动物布鲁氏菌快速检测方法的研究

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1、分类号S853.5学校代码10129UDC619学号2009301033动物布鲁氏菌快速检测方法的研究StudyontheRapidDetectionMethodsofAnimalBrucella申请人：李建云学科门类：农学学科专业：临床兽医学研究方向：奶牛及宠物疾病的研究指导教师：李云章教授论文提交日期：二〇一二年十月摘要布鲁氏菌病是一种危害严重的人兽共患病，在世界范围内广泛流行。我国布鲁氏菌病主要的诊断方法为细菌分离培养和血清学检测（虎红平板凝集和试管凝集试验），但满足不了快速检测的要求。本论文开展布鲁氏菌快速检测方法的研究，

2、从血清学抗体筛查→阳性样品的病原学检测→病原的分型鉴定，建立系列的检测方法，为布鲁氏菌病净化检疫，提供快速有效地手段。1．建立胶体金试纸检测方法，适用于现场检测。根据双抗原夹心法测抗体的原理，用葡萄球菌蛋白A和布鲁氏菌重组蛋白bp26抗原建立检测布鲁氏菌抗体的胶体金免疫层析试纸条。特异性试验结果表明，阳性和阴性血清检测结果正确，说明该方法特异性较好。试纸条保质期为4℃保存6个月。2．建立荧光定量PCR检测方法，适用于检测病原。以布鲁氏菌属OMP10保守片段为靶基因，设计特异性引物和Taqman荧光探针。将OMP10基因片段克隆到p

3、MD19-T载体，提取质粒，制备标准品及标准曲线。特异性分析结果显示，对照菌株均未出现荧光信号，说明该方法特异性较好；灵敏性分析表明，该方法最低检出数量级为-4为10ng/μL；标准质粒的稳定性试验结果表明，在不同检测时间、不同反应管之间的域值的变化很小，组内组间变异系数均小于2%。3.建立布鲁氏菌分型多重PCR方法，适用于病原进行分型。根据布鲁氏菌基因组多拷贝插入元件IS711及其下游多态位点，设计布鲁氏菌牛、羊、猪种分型引物，优化PCR反应体系和条件，建立布鲁氏菌分型的多重PCR方法。特异性分析结果显示，对照菌株未见扩增，说明

4、该方法特异性较好。灵敏性分析表明，其最低检出数-2量级为10ng/μL。关键词：布鲁氏菌；胶体金试纸条；荧光定量PCR；多重PCR；检测方法建立StudyontheRapidDetectionMethodsofAnimalBrucellaAbstractBrucellosisisonekindofamphixenosis,whichisseverelyimpairedintheworld.ThedetectionmethodsinmyCountryarebacteriologyandserology(RBTandSAT).But,

5、thesemethodshavemanydrawbacks.Itisnecessarytoestablishnewmethodstoimprovedetectionlevel.ThisstudyestablishedthreemethodstolayafoundationforBrucellosiscontrol.Tomeetthedemandofthequarantinepurificationofbrucellosis,thepapersstudyontherapiddetectionmethodofbrucellosis,t

6、heserologicaltypingidentificationofpathogendetectionantibodyscreening→positivesamples→pathogens.1.Establishedcolloidalgoldimmunochromatographyassay(GICA)forthefielddetectionbrucella.Accordingtodoubleantigensandwichdetectionantibody,weusedSPAandbp26tosetupthecolloidalg

7、oldimmunitychromatographytestpaper.ThespecifictestshowedthedetectionresultofcontrolserumwereCorrect.ThesensitivityoftestreachedthelevelofSAT.Theshelflifewas6monthsin4℃.2.EstablishedfluorescencequantitativePCR(FQ-PCR)forthequantitativedetectionbrucella.Accordingtotheco

8、nsensussequenceofbrucellagenomeOMP10,wedevisedspecificprimerandTaqmanfluorescentprobe.WehadclonedthegenepartOMP10tocarrierPM