布鲁氏菌病与结核病快速诊断技术的研究

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1、分类号：密级：学号：2009108020单位代码：10759石河子大学硕士学位论文布鲁氏菌病与结核病快速诊断技术的研究学位申请人鲁芝子指导教师陈创夫教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2012年6月EstablishedFluorescentquantitativedetectionofBrucellaandImmunochromatographicStripforDiagnosisofBrucellaserumADisserta

2、tionSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByLuZhizi(BasicVeterinaryScience)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuJune,2012学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他

3、个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日课题来源973计划项目项目名

4、称：重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及病原致病机制研究；项目编号：2010CB530200十一五国家重大疫病防控专项项目名称：结核病分子标识和诊断技术及产品的研究；项目编号：2008ZX10003-003中文摘要布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体，进而引起传染变态反应性的人畜共患传染病。布鲁菌可感染人类、多种家畜和野生动物，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。因此对该病及时作出诊断有利于降低经济损失。为此，国内外学者相继建立了很多方法，但是这些方法或技术性强不适于基层使用，或价格昂贵，操作复杂，或

5、结果不稳定。所以，建立敏感性高，特异性强，操作简便，便于基层推广使用的诊断方法是非常有必要的。本研究应用胶体金免疫层析法（GICA）研制一种布鲁氏菌病多联蛋白快速诊断试剂条，为布病的快速诊断提供了技术支持。结核病是由结核分枝杆菌感染所导致的呼吸系统感染为主的人畜共患慢性传染病，对人畜健康损害严重。全世界目前约有三分之一的人感染该病。目前，结核病呈现出扩大趋势。但现有的用于诊断结核感染的方法都存在或多或少的缺陷，突出问题是灵敏度、特异性低。因此需要一种新的诊断技术以称补现有方法的不足。据此，根据相关文献报道

6、，本实验建立了基质金属蛋白酶1和γ-干扰素体外释放试验，该法具有较高的敏感性和特异性，为结核病的早期诊断提供新的技术方法。现将主要研究成果报告如下：1.布鲁菌外膜蛋白OMP31的表达、纯化：通过分子克隆技术对目的基因omp31进行扩增，然后将omp31目的基因连接到PMD18-T载体上，经过PCR、酶切和DNA测序鉴定正确后，构建pET-32a-omp31重组质粒，转化到DE3表达菌中进行经IPTG诱导表达，最后进行westernblot检测。SDS结果显示成功表达了omp31融合蛋白，并获得了高表达量和

7、高纯度的蛋白，westernblot检测结果证明了omp31融合蛋白具有较高的免疫原性，为后续的免疫学检测奠定了试验基础。2.检测布鲁氏菌多联蛋白试纸条的制备：用柠檬酸三钠还原剂制备胶体金溶液，在此基础上摸索胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白的最佳条件；并对其进行质量鉴定。用透射电镜和紫外/可见光谱仪（400nm-700nm）分析显示，制备的胶体金颗粒大小均一，约为20nm，适合免疫标记。胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白最pH为6.2，最适稳定浓度为6µg/ml。最佳抗原包被量为1µL/cm，人IgG的最佳包被

8、浓度为2mg/ml。用研制的OMP31和BP26多联蛋白试纸条与仅有OMP31或BP26蛋白作为单一检测线的试纸条对15份布鲁氏菌标准阳性血清进行检测，多联蛋白试纸条阳检率为100%，与仅有OMP31或BP26蛋白作为单一检测线检测结果相同，与用琥红平板试验（RBPT）符合率为100%。检测其他血清结果显示该试纸条具有良好的特异性。试纸条可检出稀释125倍的羊布鲁氏菌标准阳性血清。本试纸条在4℃可保存6个月，表明该检测方法具有