布鲁氏菌荧光PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41团体标准MAT/CVMAX9—2019布鲁氏菌荧光PCR检测方法Real-TimePCRfordetectionofBrucellaspp.CVMA中国兽医协会2019-XX-XX发布2019-XX-XX实施中国兽医协会发布T/CVMAX9—2019前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准不涉及专利。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所、中国动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：秦玉明、董浩、原霖、沈青春、丁家波、彭小薇、蒋卉、冯宇、许冠龙

2、、朱良全、范学政。CVMA中国兽医协会IT/CVMAX9—2019布鲁氏菌荧光PCR检测方法1范围本标准规定了布鲁氏菌（Brucellaspp.）荧光PCR诊断技术。本标准主要用于动物中布鲁氏菌(Brucellaspp.)核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18646动物布鲁氏菌病诊断标准NY/T1467奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术3试剂与耗材3.1提取试剂宜选

3、取商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒。CVMA3.2荧光中国兽医协会PCR扩增试剂宜按照不同的荧光PCR平台的说明书选取推荐的荧光PCR扩增试剂。3.3引物探针Brucella上游引物(BruF)：5＇-cgctcgcgcggtggat-3＇Brucella下游引物(BruR)：5＇-cttgaagcttgcggacagtcacc-3＇Brucella探针(BruP)：5＇-FAM-acgaccaagctgcatgctgttgtcgatg-BHQ1-3＇1T/CVMAX9—20194仪器与设备生物安全柜、分析天平

4、、水浴锅、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨器、-20℃冰箱、涡旋震荡仪。5操作步骤5.1样品的采集及运输按照GB/T18646和NY/T1467执行。5.2样品的处理按照GB/T18646和NY/T1467执行。5.3细菌基因组提取按照所选取的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取。5.4荧光PCR扩增方法按照表1配制布鲁氏菌（Brucellaspp.）荧光RT-PCR扩增反应体系。表1布鲁氏菌（Brucellaspp.）荧光PCR扩增反应体系试剂终浓度体积a2×酶混合液/10µLBruF（10µmol/L）

5、CVMA0.3µmol/L0.6µL中国兽医协会BruR（10µmol/L）0.3µmol/L0.6µLBruP（10µmol/L）0.3µmol/L0.6µLDNA模板/2µL无菌无核酸酶水/6.2µL总体积20.0µL注：a为荧光PCR扩增试剂。将表1中所有试剂加到荧光PCR反应管后，充分混匀，做好标记。布鲁氏菌（Brucellaspp.）荧光PCR扩增所用荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ或None。在荧光PCR仪上按表2所示程序进行扩增反应。2T/CVMAX9—2019表2布鲁氏菌（Brucellas

6、pp.）荧光PCR扩增程序步骤温度持续时间循环数195℃2min1295℃15s40360℃1min注：在每个循环第二步（60℃1min）收集荧光信号。5.5荧光PCR扩增反应的对照在进行荧光PCR实验时，应设置阳性对照和阴性对照。以提取的布鲁氏菌基因组DNA溶液或含有目的片段的质粒作为阳性对照；以细菌基因组提取试剂盒的洗脱液替代DNA模板作为阴性对照。各对照PCR扩增体系中，除模板外，其余组分和PCR扩增程序同5.4。6结果判定6.1阈值设定阈值线设定于刚刚超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情

7、况进行调整。6.2结果判定6.2.1阳性对照Ct值≤35并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，实验结果成立，否则实验结果不成立。CVMA6.2.2中国兽医协会被检样品FAM荧光信号Ct值≤35并出现特定的扩增曲线，判断为阳性。6.2.3被检样品35＜Ct值≤40并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取基因组DNA，扩增后结果判定仍是可疑的，可判定为阳性。6.2.4无扩增曲线，判断为阴性。_________________________________3