单味中药脱色及复方含药血清对体外培养人a375黑素瘤细胞黑素代谢影响的研究

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1、硕士学位论文lI[1llEIlllll[fllllrlll[{llllll[[1l[1Il[{fY2257328单味中药脱色及复方含药血清对人A375黑素瘤细胞酪黑素代谢影响的研究硕士研究生：刘利利指导老师：杨柳教授摘要研究背景与目的皮肤色素代谢障碍与多种体内因素和环境因素密切相关，色素障碍性疾病(如白癜风、黄褐斑)易诊而难治。随着分子生物学技术的广泛应用，有关色素代谢的研究迅猛开展。国内外学者积极探索色素代谢的机制及影响因素，阐述中药调节色素代谢的作用机制，为治疗色素代谢性疾病寻找安全、有效的中药成分或方剂，对有关中药与色素的代谢方面进行了广泛的研究，但目

2、前对其作用机理与规律仍未能得到深入的科学阐述，因此临床上缺乏较为理想治疗手段及方法。目前许多中药对酪氨酸酶活性、黑素细胞代谢的影响已经有了初步的揭示，研究的方法技术亦日益成熟。但是，大多数研究都局限于观察单味中药或复方中药的研究上，鲜有从中药色象理论的角度设计较为系统的多层次的研究，有关色象中药对黑素代谢影响与干预机理的研究尚为缺乏。吾师杨柳教授通过长期的临床探索与理论研究，在取象比类思维启示下创立了治疗色素性皮肤病的中药色象理论，形成了具有鲜明特色的理论和治疗方法。认为中药颜色与色素性皮肤病的疗效有一定的相关性，并首次将这种表明药材颜色与疗效相关的现象称之

3、为“中药色象”，将这种治疗色素病色效相关的中药，称之为“色象中药”。初步研究中药药材颜色与色素性皮肤病的疗效之间的关系，并取得了一定的成果。我们的初步研究结果和以往学者的研究表明对药材本身的颜色与药效存在一定的关系，因此对中药色象理论的进一步研究，尤其是应用现代科中文摘要学研究方法技术，对色象中药调节与干预色素代谢机理的现代分子学研究是非常有必要的。另外，白癜风作为色素脱失性疾病的典型病种，临床上易诊而难治。中医药治疗白癜风具有鲜明的特色，强调证候分型与辨证论治。但目前白癜风的证候分型及方药种类繁多，缺乏统一性和标准化。此外，在临床实践中许多白癜风患者出现“

4、无症可辨"或“少症如何辨”的情况，基本除了皮肤出现白斑以外，没有其他特殊的伴随症状。对此，吾师提出了以“祛风、活血、补肾’’为基本治则，并结合分期论治的治疗方案。基于此，本研究通过查阅大量的文献资料及临床资料，并结合临床实践经验，在以往研究的基础上，筛选出中医传统治验及现代研究表明治疗色素病有效的使用频率高的黑白两类中药共10味，以目前研究技术较为成熟的酪氨酸酶、细胞增殖及黑素合成作为观察指标，研究单味中药经活性炭脱色后对体外培养的人A375黑素瘤细胞黑素代谢的影响，以及采用中药血清学的方法研究4种具有不同功效的复方含药血清对黑素代谢的影响，进一步探讨色象中

5、药与色素代谢的相关性，为色象理论及临床辨证用药提供科学依据，为以后白癜风的辨证治疗提供实验依据，同时为中医药治疗色素病的研究提供新的思路，以有效地指导临床。方法与内容1、通过查阅大量的文献资料及临床资料，并结合临床实践经验，在以往的研究基础上，筛选出中医传统治验及现代研究表明治疗色素病有效的使用频率高的中药，依据饮片的外在颜色分为黑(深色)、白(浅色)两组，每组各选5味药作为代表药，制备各单味中药水提液，取上述中药水提取液100ml，用紫光分光光度法进行测定吸光度值，采用正交试验法对每味中药的脱色工艺进行筛选，以最佳脱色条件进行脱色后取上清液过滤后备用，并用

6、不含胎牛血清的培养基进行稀释，使药物终质量浓度为10pg／ml。n硕士学位论文2、参照医学实验动物学及中药血清学的方法，制备四种不同功效配伍的复方含药血清，并用不含胎牛血清的培养基进行稀释，使含药血清的终浓度为5％、10％、20％、30％，并以此四种浓度进行研究。3、应用细胞培养学技术，将人A375黑素瘤细胞株进行体外培养。采用多巴速率氧化法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞中酪氨酸酶活性的影响，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞增殖的影

7、响；采用NaOH裂解法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞中黑素合成含量的影响。每种药物每个浓度设3个复孔，重复3次，并设对照组：单纯培养基组、中药对照组(培养基+中药)和空白对照组(培养基+细胞)。3、应用SPSSl3．0统计软件，分别采用单因素方差分析的Dunnett检验和析因设计资料的方差分析对单味中药和复方含药血清各组实验数据进行统计学处理与分析，数据均以；士s表示，以P郢．05时表示差异有统计学意义。结果1、单昧中药调节黑素代谢测定结果：①未经活性炭脱色的中药中，制首乌、补骨脂、丹参、鸡血藤、墨旱莲、桃仁

8、对TⅥ乇活性具有激活作用(P<0．05或脚．01)：