验方祛斑汤对a375人黑素瘤细胞黑素合成的影响论文

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1、验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞黑素合成的影响论文.freel比色法测定验方对黑素含量的影响。结果验方祛斑汤对体外培养的A375人黑素瘤细胞具有抑制细胞增殖.freelelanogenesisofA375humanmelanomacellandtoexplorethemechanismofthemontreatingchloasma.MethodsMTTanmelanomacell.Tyrosinaseactivityeasuredbyzymologicmethod.Themelanin.Res

2、ultsProvedrecipeQubansouphadtheeffectsofinhibitingtheproliferation,anddecreasingtyrosinaseactivityandmelanincontentofA375humanmelanomacellinvitro.ConclusionTherecipeiseffectiveinthetreatmentofchloasmabyinhibitingthemelanogenesisofA375humanmelanomacel

3、l.Keyanmelanoma;Melanogenesis;Chloasma黄褐斑是一种发于颜面部的色素沉着性皮肤病，其病机主要与肝、脾、肾有关。导师艾儒棣教授以滋补肝肾、益气养血、活血化淤为治则，研制了验方祛斑汤，临床治疗黄褐斑取得了较好疗效。我们研究该方对体外培养人A375黑素瘤细胞的细胞形态、细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影响，以探讨其作用机制。1材料和方法1.1细胞株及来源人A375黑素瘤细胞株由四川大学华西医学中心免疫实验室提供。1.2主要试剂及仪器左旋多巴（L－DOPA）、四甲基

4、偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）；RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）；TritonX-100（上海华美生物工程公司）。CO2培养箱（德国Heraeeus公司）；酶标仪（Model550：Bio-RAD）；倒置显微镜（德国LECIA公司）。1.3药物及制备方法验方祛斑汤（主要组成药物：黄芪、菟丝子、当归、川芎、白芍、熟地等）的中药饮片均购自成都市太极大药房。制备方法［1］：取中药加相当于药材量10倍的蒸馏水浸泡2h，第1次回流提取1.5h，滤过

5、后药渣再加10倍量水继续提取1h，合并两次滤液，离心去渣，文火煎至糊状，加20ml无菌1640液，调pH值至7.2。沉淀后吸上清液抽滤除菌，置-20℃冰箱备用。中药母液浓度为1g/ml，临用时用新鲜培养基稀释至终浓度为：0.01，0.05，0.1，0.5，1mg/ml。熊果苷:阳性对照组用药由成都万和生物工程有限公司赠。终浓度调至为：0.1，0.5，1，5mmol/L。1.4方法1.4.1人A375黑素瘤细胞培养无菌条件下，将细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基的培养瓶中，在37℃

6、，体积分数为5%CO2培养箱中培养，每3天用0.25%胰酶消化传代1次，实验用第3～4代细胞。待细胞生长到对数期，用PBS洗涤，0.25%胰酶消化，细胞计数板计数，然后接种至细胞培养板待测。1.4.2细胞增殖的测定采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）［2］：取对数生长期细胞，常规胰酶消化处理后吹打成单细胞悬液，将细胞浓度调为5×104个/ml，接种于96孔板，每孔100μl。在37℃，5%CO2培养箱中培养24h后，弃去上清液，分别加入含不同药物浓度的培养基，每孔100μl，阳性对照组为含不同浓

7、度熊果苷的培养基，空白对照组加不含药物的培养基，继续培养48h后，每孔加入MTT液20μl（5mg/ml），继续培养4h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡10min左右，于酶标仪570nm波长处测定A值。每一浓度设6个复孔，实验重复3次，取平均值。同期在光镜下观察细胞的形态变化。细胞增殖抑制率（％）＝（1－加药组A570nm/空白组A570nm）×100％。1.4.3酪氨酸酶的活性测定［3］同上细胞培养方法和分组原则，培养48h后，用0.01M,pH7.2的PBS洗涤两

8、次，每孔加入1％TritonX-100溶液50μl，迅速置－80℃冻存30min，随后室温融化使细胞完全破裂，37℃预温后加入1％L－DOPA溶液10μl，37℃反应2h，于酶标仪490nm波长处测定A值。每一浓度设6个复孔，实验重复3次，取平均值。酪氨酸酶活性抑制率（％）＝（1－加药组A490nm/空白组A490nm）×100％。1.4.4黑素含量的测定采用Hunt法［4］，酶标仪475nm波长处测定A值。每一浓度设4个复孔，实验重复3次，取平均值。黑素相对含量=加药组A475nm/空白组A4