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1、当归多糖对人黑素瘤A375细胞黑素合成及抗氧化损伤的作用1黑龙江屮医药大学佳木斯学院1540072黑龙江屮医药大学附属第二医院150009［摘要］FI的：观察不同质量浓度的当归多糖对人黑素瘤A375细胞黑素合成及抗氧化损伤的作用。方法：以终浓度为1.0mmol/LH2O2作用于人黑素瘤A375细胞，制备氧化损伤模型。并以当归多糖进行干预，采用MTT法测细胞活力，并测定黑素含量、TYR活性及氧化应激相关指标。结果：不同浓度的当归多糖处理后,其细胞活力、黑素含量、TYR活性、T-AOC和SOD活性均有所增加，MDA含量和NOS活性逐渐降低，
2、以10ug/mL和20ug/mL效果好。结论：当归多糖对人黑素瘤A375细胞的氧化应激损伤具有保护作用，可能从抗氧化应激角度对口瘢风患者发挥一定的治疗作用。［关键词］:当归多糖；人黑素瘤A375细胞；白瘢风1实验材料1.1仪器倒置显微镜（CKX4-A32PH,日本Olympus）,全自动酶标仪（680,美国BIO-RAD）,FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），超净工作台（SW-CJ-1F,苏州工业园区三兴净化科技有限公司），CO2培养箱（MCO-20AIC,□本三洋公司）1.2试剂与药物当归多糖（CY130421,陕西慈缘
3、生物技术有限公司，纯度≥95%）,T-AOC>SOD、MDA、NOS检测试剂盒（南京建成科技有限公司），MTT（美国sigma公司），DMEM培养基（GIBC0公司），胎牛血清（杭州四季青公司），H2O2等其他试剂均为国产分析纯。1.3细胞株：人黑素瘤A375细胞购白中科院上海生物细胞研究所1.4方法1.4.1细胞培养将人黑素瘤细胞A375放入含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的DMEM培养液中，并静置于37°C、5%C02培养箱中常规培养，2天换液一次，取对数生长期的细胞用于实验。1.4.2细胞氧化
4、损伤模型的制备取对数生长期的A375细胞用于实验，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，以DMEM培养液调整细胞浓度，再置于CO2培养箱中继续培养,24h后取出，分别加入终浓度为1.0mmol/LH2O2,为下一步实验做准备。1.4.3分组及给药分为6组：正常组、模型组和当归多糖不同浓度组。模型组给予终浓度为1.0mmol/LH2O2；当归多糖组先给予终浓度为1.0mmol/LH2O2,再分别加入终浓度为10、20、40、80ug/mL当归多糖；正常组给予相同体枳的DMEM培养液。1.4.4MTT法测细胞活力将A375细胞制成单细胞悬液，
5、调整细胞密度为1.5×104个/ml,接种到96孔板内，每孔200ul,置于CO2培养箱中继续培养24h后,弃掉培养液，各组给予相应的药物处理，继续培养48h,每孔再加入5g/LMTT20ul,继续培养4h后,去掉培养液，每孔加入DMSO150ulz缓慢震荡10min,放置酶标仪上在490nm处测吸光值，以A代表细胞活力。每组设8个复孔，测定3次，取其平均值。1.4.5黑素含量将细胞密度为1.5×104个/ml的A375细胞悬液接种到24孔板内，每孔lml,置于CO2培养箱中继续培养24h后，弃掉培养液，各组分别
6、给予相应的药物处理，各组溶液均为每孔lml,继续培养48h,去掉培养液，用PBS缓冲液漂洗1次,再用0.25%胰酶消化，收集各孔细胞到离心管中，1500rpm离心3min,去掉上清液，向沉淀加入lmol/LNaOH100ul,37°C放置lh,每孔再加入400ul双蒸水将NaOH稀释为0.2mol/L,轻微震荡混匀后分别取200ul加入96孔板中,应用酶标仪在490nm处测A,A表示黑索含量。每组设4个复孔，测定3次，取其平均值。1.4.6酪氨酸酶活性将A375细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1.5×104个/ml,接种到
7、96孔板内，每孔200ul,置于C02培养箱中继续培养24h后，弃掉培养液，各组给予相应的药物处理，继续培养48h后，每孔需加入l%TrionX・100溶液lOOul,于・80°C放置30min,室温缓慢溶解，每孔再加入0.2%左旋多巴溶液50ul,37°C放置lh,应用酶标仪在490nm处测A,A表示TYR活性。每组设4个复孔，测定3次，取平均值。1.4.7氧化应激相关酶的测定将细胞密度为1.5×104个/ml的A375细胞悬液接种到24孔板内，每孔1.5ml,置于CO2培养箱中继续培养24h后，弃掉培养液，各组分别给予相
8、应的药物处理，各组溶液均为每孔1.5ml,继续培养48h,收集各孔培养液，用于「AOC、SOD、MDA、NOS的测定，具体按试剂盒操作说明进行。1.5统计学处理采用统计学分析软件SPSS17.0处理，所有数
