hif-1α基因沉默对人脉络膜黑色素瘤细胞上皮—间质转化的影响

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1、HIF-1a基因沉默对人脉络膜黑色素瘤细胞上皮一间质转化的影响摘要目的：以特异性小干扰RNA(siRNA)沉默缺氧培养的人眼脉络膜黑色瘤细胞(OCM一1)中缺氧诱导因子一10【(HIF—la)基因，观察其对细胞骨架分子波形蛋白(Vimentin)表达的影响，以初步探讨HIF-1a对人眼脉络膜黑色瘤上皮一间质转化(EMT)的调控作用。方法：在正常培养基qbJJll2,．1009mol／L的氯化钴(CoCl2)以模拟肿瘤内部缺氧微环境，构建靶向HIF—ls的siRNA干扰载体，同时设立6一actinljH性对照、无义寡核苷酸阴性对照及空载

2、脂质体对照组，以LipofectamineTM2000为载体介导siRNA转染缺氧培养的OCM-1细胞，以RT-PCR和Westernblot方法检测缺氧培养前后及转染前后HIF-1、VimentinmRNA和蛋白的表达情况。结果：OCM一1细胞经缺氧培养后可由上皮细胞样形态转变成间质细胞样形态。与常氧组相比，单纯缺氧组HIF-1amRNA表达无明显差异(P>O．05)，蛋白表达显著升高(P<0．01)，而VimentinmRNA和蛋白的表达均显著升高(P

3、下降(P<0．01)，说明转染成功；HIF-la干扰组HIF—la和VimentinmRNA和蛋白表达均明显下降(P<0．01)；无义寡核苷酸阴性对照组及空载脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>O．05)。结论：1．缺氧培养可使OCM-1细胞由上皮细胞样形态转变成间质细胞样形态，提示缺氧微环境可促使OCM一1细胞发生EMT。2．缺氧可在蛋白水平上调OCM一1细胞中HIF一10【的表达，提示缺氧对HIF一10【的调控主要发生在转录后水平。3．HIF—ls可通过转录激活Vimentin，使其表达上调，提示HIF-la可能参与调控OCM

4、-1细胞的EMT，进而影响其侵袭、转移能力。4．可成功利用LipofectamineTM2000为载体将siRNA转入OCM一1细胞内。5．HIF一10【一siRNA转染OCM一1细胞可成功下调HIF-1及Vimentin的表达，进一步说明缺氧条件下Vimentin的表达、EMT的发生受HIF-la的调控；从分子水平抑制HIF—la的表达，可能抑制肿瘤侵袭、转移，从而可为肿瘤治疗提供新方向。硕士研究生：赵娟(眼科学)导师：周占宇副教授关键词：脉络膜黑色素瘤；缺氧诱导因子-1Q；波形蛋白；上皮一间质转化；基因沉默EffectofHIF-

5、laGeneSilencingonEMTInMalignantMelanomaoftheHumanChoroidCellAbstractObjectives：Toinvestigatetheeffectofspecificsilencinghypoxiainduciblefactor-1alpha(HIF·la)bysmallinterferenceRNA(siRNA)onexpressionofVimentininmalignantmelanomaofthehumanchoroidcelllines(OCM-1)underhypox

6、ia，inordertodiscusstheroleofHIF一1Qonepithelial—mesenchymaltransition(EMT)inmalignantmelanomaofthehumanchoroid．Methods：ChemicalhypoxiainducerCobaltchloride(COCl2)wereaddedintonutrientmediumattheconcentrationoflOOgmol／Ltosimulatehypoxiamicroenvironmentinsidetumor．HIF一1Q—s

7、iRNAweredesignedandsynthetizedinvitro．LipofectamineTM2000wastakentotransfectsiRNAintoOCM-1cellsunderhypoxia．Andhypoxicgroupcellsweredividedintofivegroups：simplehypoxicgroup，HIF-1Qinterferencegroup，13·actinpositivecontrolgroup，negativecontrolgroupandliposomegroup．RT-PCRa

8、ndWesternblotwereusedtochecktheexpressionstatusofHIF—laandVimentinonmRNAandproteinlevelsbeforeandafterhypoxiac