hainanenins基因克隆，活性鉴定及诱导癌细胞凋亡的机制初探

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1、硕士学位论文Hainanenins基因克隆，活性鉴定及诱导癌细胞凋亡的机制初探Genecloning，activitiesidentificationandprimarystudyofmechanismofinducingcancercellsapoptosisofHainanenins学21118070完成日期：2014．06大连理工大学DalianUniversityofTechnology大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集

2、体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。学位论文题目：}i篮幽必互勃鲴豇隆。主翻盏鉴红迹龇应窃菇J书缘作者签名：—孑侈名为擘o——一日期：韭年—厶月旦日大连理工大学硕士学位论文摘要肿瘤是全世界死亡率最高的重大恶性疾病之一，在治疗过程中常常伴随着肿瘤的多药耐药性MDR产生、降低机体免疫力，最终导致化疗失败。克服肿瘤MDR，提高药物靶向性一直是肿瘤治疗中的难点。近来，由生物基因组编码的具有抵抗外源性微生物侵害、清除体内病变细胞活性的抗癌肽ACPs，被发现具有广谱杀菌、抑病毒

3、、抑杀肿瘤细胞等作用。由于其抗肿瘤活性显著，分子量小，结构简单，理化性质稳定，不易产生耐药性，以及对哺乳动物正常细胞毒性较低等特点，已经成为抗肿瘤药物研发的热点。本实验中，以海南湍蛙(Amolopshainanensis)为研究对象，从其背皮分泌物中直接分离得到2种活性多肽。随后利用分子生物学技术，通过构建背皮组织cDNA文库，设计引物，扩增序列，最终从31个连接产物中得到10种多肽序列，通过序列比对发现这lO种多肽分属于4个家族，其中有5条高度同源的序列属于一个新的家族，并且其中一条与分泌物中纯化得到的多肽序列相同。根据物种种属名称，我们将这个家族命名为hainanen

4、ins并以序号1～5分别命名5条多肽，他们成熟肽部分都是由21个氨基酸残基组成，C末端由15位和2l位的半胱氨酸连接成含有7个氨基酸残基的二硫环。我们选取hainanenin．1和hainanenin．5检测了抗菌活性、抗氧化性、溶血性抑制抗肿瘤活性，结果显示：Hainanenin．1和hainanenin-5对17种细菌都有明显的抗菌活性，抗氧化性不明显，溶血性相对较高；其中Hainanenin．1对5中癌细胞都有明显的抑制生长的活性，IC50值在10～131xM之间，对乳腺癌细胞MCF．7的IC50值低至6．91aM。而对人脐静脉细胞HUVEC，抑制生长作用不明显，在

5、其他肿瘤细胞IC50浓度范围内，可以认为对其生长无影响。扫描电镜结果显示，经hainanenin．1处理的MCF一7，细胞膜表面微绒毛断裂，质地由粗糙变得光滑，细胞形状由贴壁的梭形变成圆形，并且细胞膜发泡形成囊状结构，并最终破裂，在膜上形成孔洞，破坏细胞膜的完整性；细胞早期凋亡时，细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻，可与膜染料AnnexinV．FITC结合，连同核酸染料PI进行双染，检测药物处理后细胞的早期凋亡率，结果显示IC50浓度的hainanenin一1处理细胞24h后，MCF一7细胞早期凋亡率达到62％：HoechsG3258染色结果显示，hainanenin．1能够引起染

6、色体凝集细胞核皱缩；最后，通过检测caspase．1，3，9的活化率发现，hainanenin．1能够大量激活MCF．7细胞内caspase3和caspase9的表达，而与细胞焦亡及炎症因子释放相关的caspase．1没有明显的被活化。我们的研究确定hainanenin．1具有明显的抗癌活性，其自身结构特点及在抗癌方面表现出的极佳活性会为hainanenin．1在医药领域的开发应用奠定基础。关键词：Hainanenins；海南湍蛙；基因克隆；抗癌肽；细胞凋亡Hainanenins基因克隆，活性鉴定及诱导癌细胞凋亡的机制初探Genecloning，activitieside

7、ntificationandprimarystudyofmechanismofinducingcancercellsapoptosisofHainaneninsAbstractAmphibians，asaspeciesresourcewithhighmedicinalandfoodvalueforsustainabledevelopment,hasbeeninpeople、Slivesforlongtime．Theirskinsecretionistreasuretrovefordrugdevelopmentwhichreco