二氢青蒿素诱导乳腺癌细胞凋亡的分子机制初探 (1)

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1、二氢青蒿素诱导乳腺癌细胞凋亡的分子机制初探研究生：顾洪涛导师：毛海婷研究员专业：免疫学中文摘要研究目的青蒿素(A=rtemisinin)最初是由我国学者从菊科植物黄花蒿(ArtemisiaannuaLinn)叶中提取分离到的具有过氧化基团的倍半萜内脂类化合物，青蒿琥酯(artesunate)、蒿甲醚(artemether)和二氢青蒿素(dihydroartemisinin)等均为青蒿素的衍生物。这类药物具有显著的抗疟疾、抗血吸虫、抗弓形虫等药理作用。目前青蒿素及其衍生物在I临床上广泛应用于抗疟治疗，是抗疟特效药。近年研究发现青蒿素及

2、其衍生物还具有明确的体内外抗肿瘤活性。其药理研究和临床验证受到了广泛关注。青蒿素及其衍生物以其独特的抗肿瘤机制，可以选择性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞作用很小，目前尚未发现与传统化疗药物存在交叉耐药，而且能通过抑制谷胱甘肽-s-转移酶的活性，逆转肿瘤细胞的多药耐药，与传统化疗药物同时应用可起到协同、增效的作用。二氢青蒿素(dihydroartemisinin)是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产物，与其他青蒿素类衍生物相比具有更强的抗肿瘤活性，但其作用机制尚不够明确。本研究以乳腺癌细胞系T47D为研究对象，通过观察DHA对T47D细胞

3、增殖，细胞周期，细胞凋亡的影响以及对胞内凋亡调控因子基因和蛋白的影响，初步探讨其诱导凋亡相关的分子机制，为DHA的临床治疗提供实验和理论依据。山东省医学科学院硕士学位论文研究方法1．采用MTT检测法细胞增殖抑制实验观察二氢青蒿素对乳腺癌细胞T47D的增殖动力学的影响，DitA浓度设5、lO、20、40、60、80、100um01／1共7组，分别培养24h，48h和72h，计算各实验点的增值抑制率，用SPSSl3软件计算药物的50％抑制浓度(IC50值)。抑制率％=(卜药物组A值／细胞对照组A值)×100％2．流式细胞术分析药物作用前

4、后乳腺癌细胞T47D细胞周期的分布情况，根据MTr结果筛选合适的药物浓度和作用时间进行分组，DHA浓度设20、40、60umol／1共3组，培养48h，加入DNA染液(P150mg／L、RNA酶lOug／mL及1％Triton—X100)500lIl避光染色30min后，300目筛网过滤后上机检测。同样实验重复3次。用随机软件分析细胞周期。3．AnnexinV—PI双染法检测药物作用前后乳腺癌细胞T47D早期凋亡细胞比例收集48h药物浓度20、40、60umol／L组及DMSO对照组的细胞，加入FITC标记的Annexin-V(20

5、mg／L)20u1和PI(20mg／L)201．tl避光双染后，流式细胞术检测。同样实验重复3次。4．逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)法检测药物作用前后乳腺癌细胞T47D胞内凋亡调控因子Bim基因mRNA水平的改变，DHA浓度设20、40、60umol／l共3组，培养48h，提取总RNA，紫外分光光度计测定oD260／oD280比值，以估算RNA样品的浓度及纯度。逆转录反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，美国Kodak凝胶成像系统成像，lDImageAnalysisSoftware软件分析各条带灰度，以与B—actin的相对比值比较mR

6、NA表达水平。5．蛋白质印迹技术(Westernblot)检测药物作用前后乳腺癌细胞T47D胞内凋亡调控因子蛋白tbid，caspase8表达的变化，DHA浓度设20、40、60umol／l共3组，培养48h，收集细胞裂解，裂解液SDS-PAGE电泳后，转膜，封闭，抗体孵育，于LAS4000mini化学发光分析仪中显影。蛋白表达水平以各组积分光密度值与actin积分光密度值比值表示。实验结果1．不同浓度的DHA作用于T47D细胞24h、48h、72h后，DMSO溶剂对照组与相应时间的细胞对照组的A值相比无显著差异(P>O．05)，各

7、浓度组与相应时间DMS0溶剂对2二氢青蒿素诱导乳腺癌细胞凋亡的分子机制初探照组A值差异均有统计学意义(P

8、的分布，cO／el期细胞比率上升，S期细胞比率下降，细胞增殖受阻在GO／G1期。3．DHA作用48h后20、40、6011mol／L浓度组乳腺癌细胞T47D的早期凋亡率分别为(20．81±0．68)％，(30．90±0．73)％，(4