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时间:2019-02-02
《二氢青蒿素诱导乳腺癌细胞凋亡的分子机制初探 (1)》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、二氢青蒿素诱导乳腺癌细胞凋亡的分子机制初探研究生:顾洪涛导师:毛海婷研究员专业:免疫学中文摘要研究目的青蒿素(A=rtemisinin)最初是由我国学者从菊科植物黄花蒿(ArtemisiaannuaLinn)叶中提取分离到的具有过氧化基团的倍半萜内脂类化合物,青蒿琥酯(artesunate)、蒿甲醚(artemether)和二氢青蒿素(dihydroartemisinin)等均为青蒿素的衍生物。这类药物具有显著的抗疟疾、抗血吸虫、抗弓形虫等药理作用。目前青蒿素及其衍生物在I临床上广泛应用于抗疟治疗,是抗疟特效药。近年研究发现青蒿素及
2、其衍生物还具有明确的体内外抗肿瘤活性。其药理研究和临床验证受到了广泛关注。青蒿素及其衍生物以其独特的抗肿瘤机制,可以选择性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞作用很小,目前尚未发现与传统化疗药物存在交叉耐药,而且能通过抑制谷胱甘肽-s-转移酶的活性,逆转肿瘤细胞的多药耐药,与传统化疗药物同时应用可起到协同、增效的作用。二氢青蒿素(dihydroartemisinin)是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产物,与其他青蒿素类衍生物相比具有更强的抗肿瘤活性,但其作用机制尚不够明确。本研究以乳腺癌细胞系T47D为研究对象,通过观察DHA对T47D细胞
3、增殖,细胞周期,细胞凋亡的影响以及对胞内凋亡调控因子基因和蛋白的影响,初步探讨其诱导凋亡相关的分子机制,为DHA的临床治疗提供实验和理论依据。山东省医学科学院硕士学位论文研究方法1.采用MTT检测法细胞增殖抑制实验观察二氢青蒿素对乳腺癌细胞T47D的增殖动力学的影响,DitA浓度设5、lO、20、40、60、80、100um01/1共7组,分别培养24h,48h和72h,计算各实验点的增值抑制率,用SPSSl3软件计算药物的50%抑制浓度(IC50值)。抑制率%=(卜药物组A值/细胞对照组A值)×100%2.流式细胞术分析药物作用前
4、后乳腺癌细胞T47D细胞周期的分布情况,根据MTr结果筛选合适的药物浓度和作用时间进行分组,DHA浓度设20、40、60umol/1共3组,培养48h,加入DNA染液(P150mg/L、RNA酶lOug/mL及1%Triton—X100)500lIl避光染色30min后,300目筛网过滤后上机检测。同样实验重复3次。用随机软件分析细胞周期。3.AnnexinV—PI双染法检测药物作用前后乳腺癌细胞T47D早期凋亡细胞比例收集48h药物浓度20、40、60umol/L组及DMSO对照组的细胞,加入FITC标记的Annexin-V(20
5、mg/L)20u1和PI(20mg/L)201.tl避光双染后,流式细胞术检测。同样实验重复3次。4.逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)法检测药物作用前后乳腺癌细胞T47D胞内凋亡调控因子Bim基因mRNA水平的改变,DHA浓度设20、40、60umol/l共3组,培养48h,提取总RNA,紫外分光光度计测定oD260/oD280比值,以估算RNA样品的浓度及纯度。逆转录反应结束后,琼脂糖凝胶电泳,美国Kodak凝胶成像系统成像,lDImageAnalysisSoftware软件分析各条带灰度,以与B—actin的相对比值比较mR
6、NA表达水平。5.蛋白质印迹技术(Westernblot)检测药物作用前后乳腺癌细胞T47D胞内凋亡调控因子蛋白tbid,caspase8表达的变化,DHA浓度设20、40、60umol/l共3组,培养48h,收集细胞裂解,裂解液SDS-PAGE电泳后,转膜,封闭,抗体孵育,于LAS4000mini化学发光分析仪中显影。蛋白表达水平以各组积分光密度值与actin积分光密度值比值表示。实验结果1.不同浓度的DHA作用于T47D细胞24h、48h、72h后,DMSO溶剂对照组与相应时间的细胞对照组的A值相比无显著差异(P>O.05),各
7、浓度组与相应时间DMS0溶剂对2二氢青蒿素诱导乳腺癌细胞凋亡的分子机制初探照组A值差异均有统计学意义(P8、的分布,cO/el期细胞比率上升,S期细胞比率下降,细胞增殖受阻在GO/G1期。3.DHA作用48h后20、40、6011mol/L浓度组乳腺癌细胞T47D的早期凋亡率分别为(20.81±0.68)%,(30.90±0.73)%,(4
8、的分布,cO/el期细胞比率上升,S期细胞比率下降,细胞增殖受阻在GO/G1期。3.DHA作用48h后20、40、6011mol/L浓度组乳腺癌细胞T47D的早期凋亡率分别为(20.81±0.68)%,(30.90±0.73)%,(4
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