cystatin m表达抗胃癌细胞增殖和迁移作用的体外研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterAninvitrostudy：OverexpressionofcystatinMonproliferationandmigrationofgastriccancercelllineByYaminZhaoSupervisor：Prof．QingxiaFanOncologyTheFirstAffiliatedHospitalMay,2014学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本

2、人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：勃冬父，日期易c：『华年厂月彩日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位

3、论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者如盈虹同期加膨年r月动同摘要CystatinM表达抗胃癌细胞增殖和迁移作用的体外研究研究生：赵亚敏导师：樊青霞郑州大学第一附属医院肿瘤科河南郑州450052背景胃癌是目前世界上死亡率位列第二的恶性肿瘤，在我国仍居消化道恶性肿瘤的首位。最大限度的抑制肿瘤的侵袭转移一直

4、以来都是肿瘤学研究的热点问题。CystatinM是一种分泌型半胱氨酸蛋白酶抑制剂。半胱氨酸蛋白酶可以降解细胞外基质，参与癌细胞的侵袭转移，所以半胱氨酸蛋白酶与肿瘤细胞的浸润转移密切相关。CystatinM可以抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，因此cystatinM很早就受到关注。最先发现的是转移乳腺癌细胞中cystatinM低表达。体外过表达cystatinM可以抑制乳腺癌细胞的侵袭转移能力。WilliamB．Coleman等发现，56％的原发乳腺癌和85％淋巴结转移乳腺癌细胞中存在cystatinM低表达。

5、后来发现卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等均有cystatinM低表达现象。本课题组前期研究发现70％胃癌组织67cystatinM表达缺失，并主要围绕cystatinM基因的DNA编码序列开展了一系列研究，利用生物信息学在线程序对cystatinM基因转录起始点上游序列的预测显示，该基因转录调控区存在高含量CpG岛，推测启动子区高甲基化可能是基因沉默的原因之一，后续实验也证明我们的推测的『F确性，胃癌细胞用甲基化酶抑制剂处理后，cystatinM重新表达，说明cystatinM启动子高甲基化与其低表达密切相

6、关。然而，cystatinM在胃癌的发生发展的作用尚不清楚，对胃癌细胞生物学行为的影响、胃癌治疗中的作用等方面尚未有研究报道。在接下的试验中，我们摘要将体外构建过表达cystatinM的载体，体外转染胃癌细胞株SGC一7901观察对其增殖和迁移能力的影响。目的通过人工合成CST6基因，构建含目的基因的载体，体外电穿孔法转染胃癌细胞株SGC．7901，观察CST6基因表达对胃癌细胞体外增殖和迁移能力的影响，为进一步探讨其抗胃癌机制提供理论依据。方法根据CST6基因mRNA序列(GenBank：NM001

7、323．3)及载体pcDNA3．1(+)结构确定合成序列，上游加入HindlII酶切位点及Kozak序列(GCCACC)，下游加入BamHI酶切位点，与pcDNA3．1(+)真核表达质粒构建重组载体。经PCR、双酶切和测序鉴定，电穿孔法转染至处于对数生长期的胃癌SGC一7901细胞株，G418筛选出阳性克隆，低浓度维持培养，构建稳转细胞系，分别命名为SGC一7901／CST6细胞、SGC-7901／pcDNA3．1(+)细胞。实验分3组：pcDNA3．1(+)一CST6组、pcDNA3．1(+)组和未

8、转染组。RT-PCR和WesternBlot分别检测3组细胞CST6mRNA矛HcystatinM蛋白的表达。MTT实验和划痕实验检测3组细胞增殖和迁移能力。实验数据采用SPSSl7．O软件进行统计学分析，经正态性检验和方差齐性检验，单因素方差分析用于多组均数比较，LSD．t法用于组间比较，P<0．05为差异有统计学意义。结果1成功构建pcDNA3．1(+)．CST6真核表达载体。2成功筛选出过表达CST6稳转细胞株，能够稳定表达cystatinM。3M