beagle犬ifn--α和ifn--β成熟肽基因的克隆及原核表达

《beagle犬ifn--α和ifn--β成熟肽基因的克隆及原核表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据ThecloningandprokaryoticexpressionofthematurepeptideofBeagleIFN一伐andIFN—ljIThesissubmittedtodaoAgriculturaIUniversityIn，FulfdlmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyPanFuxing(CollegeofAnimalScienceandVeterinarymedicine)Supervisor：YinYanboQingdao．ChinaJune，2014万方数据本研究由“

2、十二五，，农村领域国家高技术研究发展计划(863计划)提供资助(项目编号：2012AAl01303)万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：舀㈣时间：胁妒年妒谫关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印

3、件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：时间：>们妒年沙为月以j^日翮摊。尹幼帆如Ⅳ年护彩日万方数据青岛农业人学硕J：学位论文摘要BeagleIFN．仅和IFN—p成熟肽基因的克隆及原核表达摘要本实验对犬IFN．a和IFN．D进行了初步研究，具体包括以下几个方面：1、根据GenBank中收录的CalFN．位(AB255372)和CalFN．B(NM001135787)基因序列，以犬3．磷酸甘油脱氢酶(CaQ心DH)mRNA为内参

4、，分别设计合成特异性引物，建立了犬IFN．0【和IFN．DSYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明：C心N．o【、CalFN．p和CaGAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1x102拷贝／pL～lxl08拷贝／皿内均呈良好的线性关系，相关系数均大于0．994。熔解曲线呈现特异性单峰，组内、组间变异系数都少于3％，特异性和重复性较好。同时采用常规RT-PCR方法与本研究建立的方法对30份临床样品检测，结果显示[FN-(I和WN-13的阳性符合率分别是96．43％和96．55％。本研究建立的检测方法为Beagle犬IFNmRNA的定量分析提供了一定

5、的技术参考。2、根据G-enBank中收录的CalFN．位(AB255372)和CalFN．p(NM001135787)基因序列，用DNAStar相关分子生物学软件分析目的基因的信号肽和成熟肽序列，设计针对Ca蜊吨和CalFN．p成熟肽的特异性引物，利用RT-PCR从Beagle犬的脾脏中克隆到目的基因序列。用MegAlign软件分析核苷酸和氨基酸序列，发现Beagle犬的IFN．a与京巴、贵宾和藏獒的同源性达99．6％以上，与它们的氨基酸同源性超过99．4％：Beagle犬IFN．p序列与GenBank中CalFN．D(NM001135787)的同源性为100

6、％。因此，犬IFN．口和IFN．D在不同犬种中都是比较保守的。3、实验中，设计带有酶切位点的引物，将克隆到的目的基因直接连入原核表达载体pGEX．6P．1中，分别构建重组表达质粒pGEX．6P．1．FN．0【和pGEX．6P．1．IFN．B。将重组质粒导入原核表达宿主Rosetta中，进行ITPG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现目的蛋白均以包涵体的形式存在，大小分别约为44．04kD和44．15kD：BandScan5．0软件分析表明目的蛋白分别占总蛋白的30．2％和49．1％，复性后的比活性分别为1．02x106U／mg和1．25x103U／r

7、ag。通过本研究得出：由原核表达系统生产出的干扰素袁达量高，但缺点是目的万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要蛋白多以包涵体的形式存在，因此在后续的蛋白复性试验中需要摸索条件，这样才能为大规模_Y-,_lk化生产提供有效的保障。关键词：Beagle犬：IFN．傥和IFN-IB；SYBRGreenI荧光定量RT-PCR；原核表达：活性分析万方数据青岛农业火学硕J：学位论文AbstractThecloningandprokaryoticexpressionofthematurepeptideofBeagleIFN-aandIFN-FAbstractWehadaprel

8、iminarystlld