超声微泡介导野生型p53联合rb94基因转染hxo-rb44细胞的实验研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文超声微泡介导野生型P53联合RB94基因转染HXO--Rb44细胞的实验研究姓名：杨映雪申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：周希瑗201205重庆医科大学硕士研究生学位论文超声微泡介导野生型P53联合RB94基因转染Hxo—Rb44细胞的实验研究摘要目的：通过细胞实验研究超声微泡促进双基因联合转染(Rb94、P53基因)比∞．RB44细胞的研究，以探讨两种抑癌基因联合对视网膜母细胞瘤细胞的效果。初步探讨单独转染RB94基因后m(O—RB44细胞株上ⅫCA、MCB配体的表达情况。方I法：

2、1．构建重组质粒载体pⅥV01一p53，pⅥV01一Rb94，pⅥv01．p53一Rb94表达载体。2．利用UTMD方法分别转染P53组、Rb94组、以及二者联合组处理m(O—Rb44细胞后，对视网膜母细胞瘤细胞生长潘陛的影响。3．单独转染Rb94基因对比KO—Rb44细胞上NKG2D配体表达的影响。结果：1．重新构建的载体内的目标基因序列与Rb94基因和P53基因序列完全一致。RT-PCR检测结果表明Rb94基因及P53基因分别得到了有效表达。2．以连续波超声(参数：O．5W／cm2声强，辐照时间30s)，对m

3、(0．Rb44细胞进行P53、Rb94、以及P53联合Rb94基因转染。重庆医科大学磺士研宄生学位论文pⅥV01一p53与pⅥV01-p53一Rb94转染组细胞418bp的、却53基因强表达，显著高于空白组，pⅥV01组及pⅥ、，01．Rb94组(P

4、表达，说明携带有Rb94基因的pⅥV01一Rb94和pⅥV01-p53一Rb94质粒成功转染入细胞，且目标基因在1nRNA水平稳定表达。检测似0．Rb44细胞经外源基因转染后对其生长活性的影响。双质粒联合组经过超声爆破微泡处理后的MTT值明显小于其余各组。流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示pⅥvol-p53．Rb94组经超声+微泡处理后细胞早期凋亡率(35．3％±1．5l％)，明显高于其他各组。凋亡蛋白BAX的表达量联合转染组(O．322±O．028)较单独转染组显著较高。3．单独转染组(只转RB94基因)，WEs

5、TERNBLOT显示NKG2D配体：MCA、MCB蛋白表达均高于空白对照组及空质粒组，差异具有统计学意义(P值均0．05)。结论：本实验采用超声爆破微泡作为促进基因转染的手段，以视网膜母细胞瘤细胞为对象分别进行抑癌基因P53、RB94以及P53联合RB94进行转染，检测了各组基因的表达，以及对视网膜母细胞瘤细胞生长活性的影响，并检测了单独转染Rb94基因对视网膜母细胞瘤细胞上两种NKG2D配体：MCA、M【CB影响。实验

6、结果提示P53联合RB94气重庆医科大学硕士研宄生学位论文基因转染组对视网膜母细胞瘤细胞的抑制高于分别转染P53及分别转染RB94组。HX0．RB44细胞上M【CA、M【CB在单转RB94基因后有上调的作用。然而视网膜母细胞瘤的基因治疗尚处于起步阶段，且视网膜母细胞瘤细胞株上Ⅻ姆2D配体上调的因素尚处需进一步探索，本研究仅在体外实验为视网膜母细胞瘤基因治疗的初步研究做了一定的探索，为进一步进行动物实验积累一定理论依据，最终用于临床尚需更加深入研究。关键词：视网膜母细胞瘤，联合基因治疗，超声微泡，NKG2D配体EX

7、PER耵ⅥENTALRESEARCHONCO．TRANSFECTIoNoFWTP53ANDRB94GENEINToHXo．RB44CELLBYULTRASoUNDⅣⅡCRoBUBBLEABSTRACTobjectiVes：ToiflVestigatethecellgrowthi11llibite骶ctofnlmorsuppressorgene淅ldtypeP53aIldRB94世ertrans矗笼tionusinga11u1仃asound-targetedmicrobubledestllJction(UTMD)w

8、ay．Top—marilydiscussmeeXpressionofMICA、MCBontheceⅡlilleofHXO—RB44Methods：1．WbconstmctedP53andRb94co—expressionvector，meP53expressionVectora11dtheRb94expressionVector．2．wemeaSuredmeceU铲o、矾