脑缺血对大鼠脑微血管内皮细胞的损伤机制及黄体酮的保护作用

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1、郑州大学硕士学位论文脑缺血对大鼠脑微血管内皮细胞的损伤机制及黄体酮的保护作用姓名：赵源征申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：王建平201205中文摘要脑缺血对大鼠脑微血管内皮细胞的损伤机制及黄体酮的保护作用博士研究生：赵源征导师：王建平教授郑州大学第五附属医院神经内科河南郑州450052缺血性脑血管病是威胁人类健康的主要疾病之一。脑缺血后继发脑水肿、颅内压增高甚至脑疝形成是致残、致死的重要原因。脑水肿形成的解剖学基础是血脑屏障完整性的破坏，血管内水分进入脑组织。而脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularend

2、othelialcell，BMEC)是血脑屏障的最重要组成部分。BMEC的紧密连接与细胞外基质、星形胶质细胞终足一起，构成了血脑屏障的主要结构基础。BMEC不仅参与构成血脑屏障，而且多种生物活性物质由BMEC产生及分泌，这些物质具有调节血管张力、血液流动性和粘附性等功能，对维持币常血液循环至关重要。BMEC损伤是脑血管病特别是缺血性脑血管病的早期病变和摹本动因，与脑血管病发生发展密切相关，因此保护BMEC的结构和功能完整显得尤为重要。目前，对脑缺血损伤机制的研究主要集中在氧自由基、兴奋性氨基酸、细胞内钙超载、线粒体的损伤、炎症反

3、应和细胞凋亡等方面。其中，缺血后的炎症反应尤为重要，它能促进继发性脑损害，加重脑损伤，是脑缺血损伤的主要原因之一。活化的BMEC在转录因子，特别是核转录因子．rB(nuclearfactor-kappaB，NF．石B)系统的调节下，产生一系列细胞因子，如细胞问粘附分子．1(intercellularadhesionmolecule—l，ICAM．1)、血管细胞粘附分子．1中文摘要(vascularcelladhesionmolecule．1，VCAM．1)，这些因子介导或直接参与白细胞和BMEC的粘附，进而帮助其跨越BMEC，浸

4、润至缺血脑组织。流行病学调查结果显示，女性(尤其是绝经前)的缺血性脑血管病发病率远低于男性，而绝经后的发病率则显著上升。另外绝经后女性的失H民、焦虑等神经系统表现明显增多。据此认为，雌孕激素可能参与了脑血管病的发生和发展。国内对黄体酮神经系统作用的研究开展较少；国外研究多局限于外周神经损伤、脑外伤等领域，对黄体酮脑缺血保护作用机制的研究则处于起步阶段，特别是对其保护血脑屏障、减轻缺血后微血管内皮细胞损伤机制的研究尚未见报道。第一部分体外构建大鼠脑微血管内皮细胞氧糖剥夺模型及黄体酮的保护作用目的：体外研究氧糖剥夺对大鼠脑微血管内皮

5、细胞的损伤机制及黄体酮的保护作用，以探讨黄体酮保护血脑屏障的可能机制。方法：体外培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)，并构建氧糖剥夺(oxygenandglucosedeprivation，OGD)模型。流式细胞技术检测BMEC在OGD后ICAM．1、VCAM．1的表达情况。利用Westernblot方法检测大鼠BMEC氧糖剥夺后核蛋白NF—tcBp65亚基含量，染色质免疫沉淀分析(Chromatinimmunoprecipitationassaykit，ChIP)技术检测NF．KB的DNA结合活性。并以3．(4，5．二甲基噻唑

6、．2)．2，5．二苯基四氮唑溴盐【3．(4，5-Dimethylthiazol一2-y1)一2，5·diphenyltetrazoliumbromide，MTT】法检测BMEC存活率，比色法测定乳酸脱氢酶(1actatedehydrogenase，LDH)漏出率反映细胞损伤程度。为了反映BMEC的氧化应激损伤水平，利用生物化学法测定细胞培养液中及细胞内丙二醛(malondialdelyde，MDA)水平及细胞内超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxi

7、dase，GSH—Px)活性。中文摘要结果：OGD后6h可诱导BMEC的NF．KB、ICAM．1、VCAM．1表达上调，黄体酮对此有明显抑制作用。氧糖剥夺能显著提高NF．rB的DNA结合活性。黄体酮对此有明显抑制作用。OGD6h明显降低BMEC的存活率，并增加LDH释放率。OGD6h可明显增加BMEC培养基中及细胞内MDA含量，减少BMEC内SOD、GSH．Px活性。与氧糖剥夺组相比，黄体酮可明显降低培养基中和细胞内的MDA含量、提高BMEC内SOD、GSH．Px活性。结论：OGD可通过活化NF．rB、上调ICAM．1和VCAM

8、．1的表达、诱导氧化应激等途径损伤BMEC。黄体酮能减少OGD对BMEC造成的损伤。关键词：脑微血管内皮细胞；氧糖剥夺；黄体酮第二部分黄体酮对大鼠局灶性脑缺血后血脑屏障的保护作用目的：研究黄体酮对局灶性脑缺血后血脑屏障的保护作用。方法：利用大脑中动脉栓线阻断法(