纤溶酶原激活物抑制剂-1对大鼠胚肺成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制

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1、河北医科大学硕士学位论文纤溶酶原激活物抑制剂--1对大鼠胚肺成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制姓名：王卫丽申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：李文斌201203中文摘要纤溶酶原激活物抑制剂．1对大鼠胚肺成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制摘要研究背景及目的：特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)是特发性间质性肺炎中最常见的一种类型，约占47％--一71％，其预后差，生存中位时间仅为3至4年。IPF主要病理特征为肺泡I型上皮细胞、血管内皮细胞及基底膜的损害，并伴有嗜中性粒细胞

2、、巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润，同时肺泡II型上皮细胞与成纤维细胞异常增生，胶原过度沉积。IPF的基本病因目前还不清楚，在以往的研究中多认为与多种细胞因子参与的炎症和纤维化过程有关，如：转化生长因子．p(TGF—p)、肿瘤坏死因子．伐(n师．Q)、血小板源性生长因子(PDGF)、基质金属蛋白酶MMP笙寸。纤溶酶原激活物抑制剂．1(Plasminogenactivatorinhibitor-1，PAI．1)的主要作用是抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase．typeplasminogenactivator，uPA)和组

3、织纤维蛋白溶酶原激活剂(tissue—typeplasminogenactivators，tPA)，它与U．PA或t．PA形成1：1复合物，灭活纤溶酶原。目前研究认为，在肺纤维化的发展过程中，PAI．1调节体内多种细胞如白细胞、纤维母细胞的黏附和移行，进入损伤组织，并与多种细胞因子TGF．p、TNF．0c、PDGF等相互作用，进一步上调自己的表达，使PAI．1大量分泌，活性升高，u．PA活性降低，纤溶系统受到损害，不能完全清除已形成的纤维蛋白，从而加速肺纤维化的发生发展。虽然IPF潜在的发展机制不清楚，最新的证据表明，增JJNP

4、AI．1的表达对IPF发病机制有很重要贡献。博莱霉素(Bleomycin，BLM)致肺纤维化的转基因大鼠模型证实了肺纤维化的程度与PAI．1的基因密度呈明显正相关。目前，已有应用siRNA技术沉默PAI．1表达减轻肝纤维化的报道。体外研究表明，PAI．1可以促进肝星状细胞、血管平滑肌细胞增殖，并抑制其凋亡。本研究中，为了探讨PAI．1在肺纤维化发生中的作用，我们将体外培养的大鼠胚肺成纤维细胞加入外源性PAI．1，观察成纤维细胞增殖、转化、胶原合成的变化。进一步通过TNF一0【诱导成纤维细胞凋亡中文摘要后，观察PAI．1对体外培养

5、的大鼠胚肺成纤维细胞自发及诱导凋亡的影响及机制。方法：l外源性PAI。l对成纤维细胞增殖的影响及信号转导通路将冻存的大鼠胚肺成纤维细胞复苏后，分为以下三组：Control组、PAI．1组和TGF．13组。在培养液中分别加入相应的物质伎其浓度分别达到20ng／ml(PM．1)和2ng／ml(TGF．13)。我们前期研究结果表明，这一浓度促进成纤维细胞增殖最明显。应用westernblotting法分别测定24h、48h和72hPAI一1、c【一SMA、AKT、P—AKT、ERK、P—ERK蛋白的表达；应用RT-PCR和Realti

6、mePCR分别测定24h的PAI．1、a．SMA、I型胶原、III型胶原mRNA的表达；应用激光共聚焦显微镜观察24h、48h细胞内游离Ca2+浓度的变化。2外源性PAI．1对成纤维细胞凋亡的影响及信号通路将冻存的大鼠胚肺成纤维细胞复苏后，分为以下四组：Control组、PAI．1组、TNF—a+anti—Fas组和TNF．a+anti．Fas+PAI．1组。在培养液中分别加入相应的物质，使其在培养液中达到如下浓度：PAI．1：20ng／ml；TNF．a：20ng／ml；anti．Fas：1gg／ml，应用westernblot

7、ting法测P触一1、Caspase．3、NF．KB、AKT、P．AKT、ERK、P．ERK蛋白的表达。3统计学处理数据用均数土标准差(X士SD)表示，采用社会科学统计程序(StatisticalProgromforSocialSciences13．0)进行统计学分析，观察组与对照组的样本均数比较采用单因素方差分析，P<0．05为差异有统计学意义。比较组间差异，有显著差异者用最小显著差法(1eastsignificantdifference，LSD)进行两两比较，P<0．05为差异有统计学意义。结果：1复苏后的成纤维细胞呈圆球形

8、，约4—5小时即贴壁、开始伸展，完全伸展的细胞形状如梭形，细胞透亮，连接紧密，逐渐生长呈放射状，互相连接，复苏成功的细胞为第2代，实验用第3．5代。2经过外源性PAI．1刺激后，可以使成纤维细胞内PAI．1在24h高表达，并持续到72h。同时，使成纤维细胞内0【