水稻和红麻雄性不育相关基因ms5的克隆、表达及转基因研究

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1、广西大学博士学位论文水稻和红麻雄性不育相关基因MS5的克隆、表达及转基因研究姓名：唐向民申请学位级别：博士专业：作物遗传育种指导教师：周瑞阳201206水稻和红麻雄性不育相关基因MS5的克隆、表达及转基因研究摘要MS5(malesterile5)基因又名POLLENLESS3基因或TDMl基因。MS5最早在拟南芥发现，且是一个育性相关的基因，MS5突变会导致雄性不育。相关研究显示，它在调控细胞周期活动及在发育的花药细胞的减数分裂过程中起着关键作用。MS5突变体由于在第二次减数分裂后出现了一次额外的分裂，而染色体没有

2、复制，结果导致染色体异常，出现多分体。其编码的蛋白产物类似小鼠联会复合体蛋I兰tSCPl，遗传分析显示它是一个细胞核隐性孢子突变体(Chaudhuryeta1．，1994)。MS5基因属于一个植物界中高度保守的小的多基因家族的成员。李刚(2009)采用同重标签相对与绝对定量(iTRAQ)标记分析了红麻不育系L23A和保持系L23B单核期花药线粒体的蛋白质组差异，共鉴定出93个显著差异的蛋白质。在所鉴定的差异蛋白中，将No．326蛋白与水稻蛋白质数库进行比对，鉴定出No．326蛋白与POLLENLESS3基因高度同源

3、，POLLENLESS3，又名MS5基因。本研究基于从李刚研究结果，再次通过搜索比对各核酸及蛋白数据库，从水稻基因组序列里选择与红麻No．326蛋白同源性最高的水稻POLLENLESS3的3个基因进行研究，其基因登陆号分别为为Os05943040，Os03906970和Os09936740。在水稻基因组数据库里有4个MS5同源基因，其功能未被注释。本研究将挑出来3个基因分别命名为OsMs5．，，OsMs5．2，OsMs5-3，并对这3个基因进行了序列分析，通过RNAi基因沉默及超量表达来研究这3个基因的功能，同时我

4、们还克隆了红麻的MS5基因，并也作了序列分析及在水稻中超量表达，为了解决基因工程创造细胞核雄性不育系的保持问题，我们还对烟草刷硎进行功能研究，通过对水稻与红麻MS5基因及烟草EPSPSl的功能研究，得出如下结果：1、3个水稻基因的分离与序列分析。我们从水稻分离OsMs5．J，OsMs5．2，OsMs5．3基因全长片段，对水稻OsMs5一J，OsMs5—2，OsMs5—3基因进行生物信息学分析，3个MS5蛋白分别编码含有299、315和515个氨基酸残基的蛋白质。经Scanprosite软件分析发现，3个MS5均含有

5、一个TPR结构域(PS50005)，属TPR蛋白家族成员。水稻和红麻雄性不育相关基因MS5的克隆、表达及转基因研究序列分析显示OsMs5．．『，OsMs5．2，OsMs5—3基因与拟南芥MS5基因高源同源，以上结果表明以上OsMs5一，，OsMs5．2，OsMs5．3蛋白是MS5基因的同源基因。2、为了对OsMs5．』，OsMs5—2，OsMs5．3基因进行功能分析，我们通过构建水稻OsMs5一J，OsMs5．2，OsMs5．3，3个基因的RNAi干扰表达载体，并以中花11为受体材料用农杆菌介导法转化水稻，分别获得

6、转基因的阳性植株。对干扰表达转基因植株T1代以印珊基因片段为探针进行Southem分析证明，获得了转基因阳性植株。对3个基因的RNAi干扰转基因水稻后代进行形态及光学显微镜和扫描电镜观察，结果显示，TO代的转基因植株表现不同程度的不育。转基因植株的花粉也不同于野生型植株花粉。3、构建水稻OsMs5．，、OsMs5．2和OsMs5—33个基因带GFP标记基因的超量表达载体，并通过农杆菌介导法转化水稻。并以粳稻中花11为受体材料，农杆菌介导法转化水稻，分子鉴定获得了阳性植株。为了对水稻OsMs5一Jf、OsMs5—2和

7、OsMs5．3基因进行亚细胞定位预测，用3个带GFP的转基因植株的幼苗根尖与愈伤组织压片置于荧光显微下观察绿色荧光蛋白GFP的表达。转基因植株能观察到被蓝光激发出耀眼的绿色荧光。4、为了研究臃5同源基因在红麻(HibiscuscanabiusL．)花药中的转录特征，以不育系L23A为试材，基于已知的红麻MS5基因57端cDNA序列，采用37RACE和RT-PCR技术对该基因全长cDNA序列进行了克隆。序列比对分析结果表明，红麻花药组织中同时存在MS5基因2种不同的转录本，其长度分别为972bp,l：11105bp，

8、依次命名为胁5一仅和眦5一口。这2种转录本均包含了完整且一致的编码序YIJ(CDS)，全长为858bp，预测编码的蛋白质含有285个氨基酸残基，相对分子量为32．4kD，理论等电点为7．62。两者57端前972bp序列完全一致，但37端的非编码区(UTR)长度有所不同，HcMs5一p在第972bp以后比HcMs5．Q多出133bp的序列，具有选择性转录终止的