慢性粒细胞白血病中mir-146a低表达的调控机制研究

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1、南方医科大学2008级博士学位论文慢性粒细胞白血病中miR．146a低表达的调控机制研究Thedown—regulationmechanismofmiR-146ainCML专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员临床检验诊断学王丽娜王前教授高天明教授李林教授吴晓蔓教授温旺荣教授郑卫东教授裘宇容教授郑磊教授论文评阅人杨红玲教授平宝红教授马文丽教授均又阴教搜2012年5月6日广州慢性粒细胞白血病中miR-146a低表达的调控机制研究博士研究生：王丽娜指导教师：王前摘要微小幽s(trdCroRNAs，mJRNAs)

2、是18．24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，它可以通过与靶mRNA3'UTR区互补结合，抑制靶基因表达或促使靶基因降解，在基因转录后水平上，对基因的表达起负调节作用或基因沉默，具有调节发育时相的作用，并参与多种疾病过程。miR．146a是在固有免疫中具有重要作用的miRNA。抗细菌感染反应通过NF．KB使miR-146a表达增加，miR-146a又可抑制下游固有免疫受体TRAF6和IRAKl的表达，对炎症反应起重要的负反馈抑制作用。MiR-146a在免疫系统中也可作为肿瘤抑制因子发挥作用：敲除miR．145及miR一14

3、6a可以导致骨髓增生异常综合症(myelodysplastiesyndrome，MDS)缺失miR．145及miR．146a，会在小鼠模型中导致白血病的产生；重新表达miR．145或miR-146a则阻止了白血病细胞的生存及生长。慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)是造血干细胞水平发生的获得性恶性血液肿瘤。染色体异位t(9；22)(q34；ql1)形成BCPJABL融合基因，其编码的特异性融合蛋白BCR／ABL具有强烈酪氨酸激酶活性，异常调控多种生物学行为，引发宿主细胞恶性转化。BCR／

4、ABL调节的主要信号通路有NF．r,B、STATs、P13K、RAS．MAPK途径等。NF．xB二聚体对靶启动子的结合启动了多中文摘要种免疫调节基因的转录激活。通过抑制BCR／ABL融合酪氨酸蛋白激酶活性，进而逆转其下游信号通路来治疗CML已有近十年的历史，其中最有代表性的BCR／ABL抑制剂就是格列卫(Gleeve，imatinibmesylate，STl571)。用格列卫抑制CML细胞的BCR／ABL活性会抑制NF．1(B的转录活性，受NF．1(B调控的基因表达也将受到抑制，其中包括miRNAs。’但影响细胞内miRN

5、As水平的因素很多，归纳起来有如下几种：第一，某条／某些染色体发生缺失等异常改变，会导致定位于该条／该群染色体上的pre．miRNA基因缺失或拷贝数异常，进而导致成熟miRNAs水平的改变。第二，pre．miRNA基因启动子上游区域发生甲基化等表观遗传学改变，抑制转录。第三，与pre．miRNA基因启动子结合的一种或数种转录因子的在胞核中的浓度水平，或与启动子区结合的能力发生了改变，导致转录过程异常激活或抑制。第四，大部分miRNAs由RNA聚合酶II转录成长RNAs，再由Drosha酶转变成70nt的pre—miRNAs

6、。pre—miRNAs由Exportin5转移至细胞浆，并由Dicer酶转变成22nt的成熟双链miRNAs，其中一条链被装配到RNA诱导沉默复合体(RNA—inducedsilencingcomplex，RISC)中发挥作用。miRNAs加工成熟过程中相关的酶和蛋白等水平异常改变，会导致某些成熟miRNAs的水平降低。第五，细胞通过胞吐／胞吞作用，主动以囊泡的方式排出或从外环境中摄取miRNAs，导致细胞内特定miRNAs的浓度水平发生改变。本研究的目的是观察BC啪L抑制剂格列卫作用后CML患者及细胞系K562细胞中mi

7、R-146a及miR．29的表达水平变化，探讨甲基化酶水平的改变。观察miR．146a表达水平对K562细胞的作用，并探讨K562细胞中miR-146a维持在较低水平的可能机制。’我们通过台盼蓝染色及MTT的方法，观察了格列卫对K562细胞的增殖抑制作用，并用SPSSl3．0软件，计算出格列卫作用于K562细胞时的IC50浓度为Ⅱ博士学位论文40．859mol。通过茎环引物法及荧光定量PCR的方法检测不同浓度(309mol、509m01)格列卫作用于K562细胞后，两种miRNAs的表达水平，观察到作为NF．r,B的下游靶

8、基因之一，miR．146a的表达在格列卫作用后并未受到抑制，反而表达水平升高，计算用药组相对于生理盐水对照组miR．146a表达水平的倍数(设定对照组表达水平为1)，结果以log(2"ddQ)表示，计算均值及SE，低浓度组miR-146a表达水平为1．423±0．093(97．5％CI(0．844，2．