小鼠gitraa22-153-fc融合蛋白的表达及干预小鼠胶原诱导性关节炎发病的研究

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1、江苏大学硕士学位论文小鼠GITRaa22--153--Fc融合蛋白的表达及干预小鼠胶原诱性关节炎发病的研究姓名：魏衍财申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：王胜军20120607江苏大学硕士学位论文摘要目的：克隆人IgGlFc段(hIgGlFc)基因，构建pET32a(+)-mGITRaa22．153mgGlFc原核表达载体，并在体外表达、纯化mGITRam．15州gGlFc(GITR-Fc)融合蛋白；建立小鼠胶原诱导关性节炎(collagen．inducedarthritis，CIA)模型，观察GITR-Fc蛋白对CIA发病的影响，并寻找其作用机制。方

2、法：(1)采用PCR的方法，扩增MgGlFc基因，连接至PMD．18T载体，选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定。用酶切方法从阳性T．A克隆中获得hIgGlFc基因，连接至pET32a(+)一mGI‰．153(由本实验室保存)质粒和pET32a(+)质粒，并转化至EcoliDH5a宿主菌，选择阳性菌落进行增菌，抽提质粒，并进行酶切和PCR鉴定。将重组质粒pET32a(+)-mGITRaaz2．153-hlgGlFc和pET32a(+)-hlgGlFc分别转化EcoliRosetta宿主菌，通过PCR和酶切鉴定阳性菌株，经0．5mmol／L异丙基⋯13D硫代半乳糖苷(

3、isopropylp—D一1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导蛋白表达，表达蛋白经ProfinityIMACNickel柱纯化、去除内毒素，并通过Westernblot进行鉴定。(2)取等体积0．29／L鸡II型胶原(CII)与弗氏完全佐剂l：1混合，充分研磨至混合物完全乳化，取乳化后的CH于小鼠(100I．tgCII／只)尾根部皮内注射。第一次免疫当日为0天，于免疫后第21天用CII与弗氏不完全佐剂的乳化物加强免疫，建立CIA模型。将模型小鼠随机分为CIA模型组(CIA)、CIA．目的蛋白组(CIA．GITR．Fc)和CIA．对照蛋白组

4、(CIA．Fc)。于免疫第18天时，通过尾静脉分别注射801xgGITR—Fc蛋白及80I，tg对照蛋白，观察小鼠发病进程(临床评分，CIA发病率，病理学检查等)；利用流式细胞术检测小鼠脾脏中Tfh细胞和B细胞的比例、数目变化；利用ELISPOT检测脾脏和骨髓中抗CII特异性抗体分泌细胞的变化。结果：(1)成功构建pET32a(+)一mGITRaa22．153一hIgGlFc重组质粒和pET32a(+)-hlgGlFc重组质粒，经PCR和双酶切鉴定分别可见在1461bp和1047bp位置处出现条带，并且测序结果与mGITRaa22．153基因和hlgGlFc基因序

5、列完全一致。小鼠GITI≈aa22．153．Fc蛋白的表达及干预小鼠胶原诱导性关节炎发病的研究(2)将阳性克隆载体转化EcoliRosetta宿主菌，确定终浓度1．5mmol／LIPTG，温度25"C，诱导时间6h为最佳诱导条件，通过ProfinityIMACNickel柱纯化目的蛋白纯度>90％，获得原核表达的GITR．Fe蛋白和hlgGlFc(Fc)蛋白，相对分子质量大小分别为72KD、56KD。所得蛋白经Westernblot鉴定为GITR-Fe蛋白和Fc蛋白。(3)成功建立小鼠CIA模型，关节炎发病率为80％。在关节炎模型第45天时，GITR-Fc组小鼠的

6、关节炎发病率(27％)明显低于对照蛋白组(100％)和CIA组(80％)；病理学检查发现GITR-Fc组小鼠关节滑膜炎性细胞的浸润及骨的侵蚀较对照蛋白组和CIA组明显减轻。ELISPOT检测发现与对照蛋白组和CIA组相比，GITR-Fe组脾脏中抗CII特异性抗体分泌细胞数目明显下降，结果有显著差异(尸

7、(氏O．05)；与对照蛋白组和ClA组相比，GITR．Fc蛋白处理组小鼠脾脏中Tfh细胞比例(1．39-士0．84％)明显减少，有显著差异(尸<0．05)；同时根据计算发现，GITR-Fc蛋白组小鼠脾脏中Tm细胞数目(2．20X105±1．14×105)明显下降，有显著差异(尸

8、键词：GI