xiap-shrna对老年性聋小鼠听觉皮层gaba能神经元凋亡的作用

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1、第三军医大学硕士学位论文XIAP--ShRNA对老年性聋小鼠听觉皮层GABA能神经元凋亡的作用姓名：吴晓平申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：陈继川201205第三军医大学硕士学位论文XIAP—ShRNA对老年性聋小鼠听觉皮层GABA能神经元凋亡的作用摘要研究背景及目的：老年性聋(presbycusis)是随年龄增长而引起听觉器官衰老、退变进而出现的双侧耳对称的、缓慢进行性的感音神经性听力减退，其病因主要可归纳为遗传性因素和环境因素共同作用的结果，其中对后天环境因素与老年性聋的关系的影响多集中于环境噪音、耳毒性药物、糖尿病、心血管病等等

2、这些方面。在对老年性聋的研究中发现该病重要的病理学变化是听觉神经细胞的凋亡，并且研究显示老年性聋可能是中枢听觉系统与外周听觉系统功能联合降低衰变的结果。X染色体相关凋亡抑制蛋白(X—chromsome—linkedinhibitorofapoptosisprotein，XIAP)作为哺乳动物类凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族中的重要成员，可同时在运动神经和感觉神经系统中表达，可通过抑制caspase蛋白酶家族激活级联反应进而抑制神经细胞的凋亡，而在初级听皮层中作为主要的分泌抑制性神经递质的GABA

3、能神经元，其在听觉皮层的结构和信号传导编码过程中具有重要作用，本课题运用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术对听觉皮层GABA能神经元中XIAP基因的表达进行干扰，证明XIAP的表达水平对听觉皮层GABA能神经元的凋亡有重要作用，并揭示GABA能神经元在老年性聋疾病发生及发展中的作用。为老年性聋的发生发展提供重要理论依据，为防治老年性聋提供新的参考意见。材料和方法：1．听皮层GABA能神经元凋亡对老年性聋疾病发生发展的影响及作用。随机抽取年轻组(2月龄)、老年组(10月龄)C57BL／6J健康小鼠各20只检测ABR后，获取皮

4、层标本，双荧光抗体间接染色一激光共聚焦检测两组听皮层GABA能神经元凋亡程度及XIAP的表达水平。2．针对XIAP基因ShRNA干扰质粒的构建及功能鉴定。6第三军医大学硕士学位论文通过GeneBank查找小鼠XIAP全组基因序列，针对该基因设计3条干扰序列，构建成干扰质粒，测序鉴定后命名为XIAP—ShRNA—A、XIAP—ShRNA—B、XIAP—ShRNA—C，经鉴定后在体外细胞水平检验其功能及作用效果，即：原代培养孕14～16天C57／BL6J小鼠大脑皮层神经细胞，纯化并进行B—tubulin荧光染色鉴定；同批次细胞导入XIAP．ShRNA

5、干扰质粒，经RT—PCR、western—blot检测神经元内XIAP表达水平；流式细胞术检测导入后神经元凋亡情况，证明其功能效果并筛选最佳干扰序列质粒。3．活体内检测XIAP．ShRNA干扰质粒对老年性聋听皮层GABA能神经元的作用。在立体定位仪及微量注射仪的帮助下将XIAP—ShRNA质粒导入听皮层，并于导入前、导入后l4天和1月，检测ABR，并利用TUNEL法，检测年轻组及老年组C57BL／6J小鼠听觉皮层GABA能神经元凋亡，XIAP的表达水平，确定皮层神经元凋亡程度及其与各自对照组差异。并通过检查听觉皮层中caspase一3的表达情况探

6、讨GABA神经元凋亡的机制。结果：1．年轻组小鼠ABR检测lKHz、2KHz、4KHz、8KHz、l6KHz听力阈值分别为23．50±3．15dBSPL、32．75±4．99dBSPL、40．5±5．36dBSPL、60．25±5．73dBSPL、66．00±6．19dBSPL，而老年组小鼠在1KHz、2KHz、4KHz、8KHz、16KHz的听力阈值为60．50±6．69dBSPL、62．25±4．02dBSPL、65．75±4．55dBSPL、81．50±4．77dBSPL、85．50±4．44dBSPL。在各个频率上老年组听力阈值均比年轻组

7、显著增高(P<0．0I)。2．在年轻组小鼠听皮层中GABA能神经元凋亡阳性的数目较小，经图像分析系统计数，TUNEL法结合间接免疫荧光法检测听皮层凋亡的GABA能神经元数目约为：10．22±0．84，而同样的方法检测老年性小鼠听皮层中凋亡的GABA能神经元数目约为19．17±4．06。老年组小鼠比年轻组小鼠听皮层凋亡的GABA能神经元明显增多(P<0．01)，而年轻组小鼠听皮层的GABA能神经元XIAP表达数目较多，经分析计数，其数目为：47．83±6．77，老年组小鼠听皮层的XIAP数目为：13．27±6．94，年轻组听皮层表达XIAP的GAB

8、A能神经元明显多于老年组(P<0．01)。3．通过GeneBank查找小鼠XIAP全组基因序列，设计针对小鼠XIAP基因的3条RNA干扰