mitf、pax3和sox10基因突变致waardenburg综合征发病的机制研究

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1、博士学位论文MITF、PAX3和SOXIO基因突变致Waardenburg综合征发病的分子机制研究StudiesofMolecularMechanismofWaardenburgSyndromeCausedbyMutationsofMITF,PAX3，andSoXlOGenes作者姓名：学科专业：学院(系、所)：指导教师：张华耳鼻咽喉科学湘雅医院冯永教授论文答辩日期型!三：!：i／答辩委员会主席中南大学二0一二年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已

2、经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：也年工月卫日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。储签名：监垒新签名盈、期：丝年L月旦日◆本研

3、究由以下基金资助：1．国家863项目(NO．2007AA022445)2．国家自然科学基金面上项目(NO．30671150，81170923)◆本研究全部工作均在中南大学医学遗传学国家重点实验室完成博士学位论文中文摘要摘要Waardenburg综合症(Waardenburgsyndrome，WS)是最常见的常染色体显性遗传性综合征型耳聋，根据临床特征分为4型(WSl．4)。由于表型的不全外显，基因型和表型之间无固定内在因果模式。中国人群WS的相关研究以基因组水平研究为主，主要限于小样本的家系调查和相关基因突变检测，MITF、PAX3和SOXl0是主要的致病基因。在前期

4、的研究中，我们对中南地区22例WS患者进行了临床诊断和分型(其中家系4个共9例，散发13例)，WSl型5例，WS2型15例，WS4型2例。检测共发现9个新发杂合突变，致WSl的MITF基因突变T192fs和R217I；致WSl的PAX3基因突变H80D和H186fs；致WS2的SOXl0基因突变G37fs，G38fs，R43X和E248fs；致WS4的SOXlO基因突变W85X。这些基因突变导致WS的分子机制还不清楚。为进一步研究中国人群WS患者发病的分子机制，我们利用这9个新发突变对致病基因MITF、PAX3和SOXl0的功能进行相关的一系列体外实验研究，包括突变基

5、因真核细胞表达载体构建、Westernblot检测蛋白表达、荧光素酶检测蛋白活性、细胞免疫荧光观察亚细胞定位、免疫共沉淀检测蛋白相互作用及蛋白质DNA结合等，在转录和转录后水平研究突变蛋白功能改变及其对野生蛋白功能的影响。结果发现9个基因突变产生的突变蛋白功能均发生了改变。野生型和突变体真核细胞表达载体在293FT细胞内均能正确表达。荧光素酶活性检测发现除R217IMITF和H80DPAX3有部分残余功能外，其他突变体均失去功能，不能激活靶基因的转录活性。除E248fsSOXl0具有显性负性效应外，其余8个突变体均不能影响其相应的野生型蛋白的正常功能。在NIH3T3细

6、胞中的亚细胞定位研究发现博士学位论文中文摘要R217IMITF、H80DPAX3和E248矗SOXlO与野生型蛋白亚细胞定位一致定位于细胞核内，其余突变体出现异常的亚细胞定位，细胞核与细胞质均有分布，其中H186fsPAX3、G38fsSOXlO以细胞核分布为主，T192fsMITF和SOXl0的突变体G37fs、R43X、W85X以细胞质分布为主。免疫共沉淀发现H80DPAX3和H186fsPAX3均与野生型SOXl0蛋白有相互作用，但二者失去与野生型SOXlO蛋白的协同激活作用，不能协同上调MITF表达；5个SOXl0突变体均不能与野生型PAX3产生协同效应而上调

7、MITF表达水平，除E248fsSOXl0外，其余4个SOXl0突变蛋白均不能与野生型PAX3蛋白有相互作用。蛋白质与DNA结合实验发现E248fsSOXl0与DNA产生结合，进一步支持其显性负性效应作用，但其半衰期变短，与野生型SOXl0蛋白相比降解加快。本研究得出以下结论：(1)R217IMITF尽管与野生型MITF蛋白亚细胞定位相同并存有部分功能，但其剂量不足以达到野生型MITF蛋白行使正常生理功能所需水平。T192fsMITF无功能与其功能域bHLH．Zip的缺失及异常的亚细胞定位相关。这两个MITF突变蛋白通过下调酪氨酸酶基因表达。(2)尽