lrp16对hela细胞的放化疗敏感性的影响及其机制

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1、军医进修学院解放军总医院硕士学位论文LRP16对HeLa细胞的放化疗敏感性的影响及其机制姓名：段玉坤申请学位级别：硕士专业：妇产科指导教师：孟元光；韩为东2012-05军医进修学院硕士学位论文题目：LRPl6对HeLa细胞的放化疗敏感性的影响及其机制中文摘要DNA损伤是对于细胞稳定性和基因完整性的主要成胁之一。细胞的损伤应答机制对于细胞的存活和防止肿瘤的形成非常重要。DNA损伤常涉及多种应答方式，包括有DNA损伤修复，细胞周期关卡，凋亡通路等。在各种DNA损伤形式中，DNA双链损伤(DNAdouble．strand

2、breaks，DSB)最具细胞毒性作用，可由电离辐射(ionizingradiation，IR)、拓扑异构酶I或II的抑制剂，和代谢过程中形成的氧自由基等诱导发生。LRPl6属于Macrodomain家族蛋白成员之一，研究证实它与多种肿瘤细胞的放化疗抵抗有关。本室先前的结果证实内源性的LRPl6与NF．KB的亚单位之一p65之间有相互作用，在TNF．0【存在条件下，抑制LRPl6内源性表达，可以显著抑制NF．KB的转录活性。我们主要研究在电离辐射和依托泊苷(ETO)诱导条件下，LRPl6对细胞的放化疗抵抗的调控作用

3、。方法：首先，通过单细胞凝胶电泳(SCGE)实验检测LRPl6对于DNA损伤的作用，进一步采用WesternBlot检测、／H2AX的表达水平来验证LRPl6对DNA损伤的作用。之后分别通过CCK．8法和AnnexinV标记与流式细胞计数的方法检测了LRPl6对细胞活力和凋亡的影响。最后通过RT-PCR法检测NF．rd3下游靶基因的转录水平。结果：LRPl6表达的增加下调了电离辐射和依托泊苷诱导的HeLa细胞损伤程度，抑制了DNA损伤修复；LRPl6能够抑制IR和ETO诱导的细胞毒性作用；在抑制内源性LRPl6的表

4、达条件下，细胞的凋亡率显著增加；但过表达LRPl6时，存在细胞种类差异，并且对不同损伤诱导因子作用下，对其凋亡率的影响也存在差异。军医进修学院硕士学位论文通过RNA干扰技术沉默HeLa细胞中内源性LRPl6的表达可以降低NF—v,B的转录活性，下调了其下游凋亡相关靶基因。结论：本研究表明LRPl6能增强肿瘤细胞对放化疗的抵抗作用，这可能是通过调控NF一1(B的转录活性来实现的。关键词：辐射抵抗；放疗抵抗；LRPl6；核转录因子．rd3第一部分LRPl6对HeLa细胞DNA损伤的影响中文摘要目的：研究LRPl6基因的

5、表达与HeLa细胞的DNA损伤程度的相关性方法：1．通过转染质粒pCDNA3．1．LRPl6实现LRPl6的过表达，蛋白印迹实验检测蛋白表达水平；2．用单细胞凝胶电泳法(SCGE)，通过CASP软件分析OTM值和taillength两个指标；3．采用细胞流式技术检测各组细胞中7H2AX表达量。结果：1．蛋白印迹实验结果示：转染了pCDNA3．1一LRPl6的HeLa细胞LRPl6的表达量与空质粒pCDNA3．1相比明显增高；2．采用图像软件CASP分"析SCGE结果：分别用IR或ETO处理细胞后，LRPl6过表达组

6、与空质粒相比，OTM值和taillength两个指标的值有统计学差异(p<0．05)3．流式细胞检测结果：分别用IR或ETO处理细胞后，LRPl6过表达组与空质粒相比，超过预设荧光强度值的细胞数占总细胞数百分比差异显著(P

7、托泊苷诱导的肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法：1．将抑制LRPl6表达的小干扰RNA，controlsiRNA，siRNA一374，siRNA一668，分别转染入HeLa，H1299，MCF．7细胞内，并通过电离辐射或依托泊苷处理的细胞；用CCK-8检测细胞活力；用DAPI染色和流式细胞技术测定抑制LRPl6的表达对HeLa细胞的凋亡率的影响；2．将转染了质粒pcDNA3．1和pcDNA3．1．LRPl6的分别转染入HeLa，H1299，MCF一7细胞内，并通过电离辐射或依托泊苷处理的细胞；用CCK-8检测细胞活力；

8、用流式细胞技术测定LRPl6的表达对HeLa细胞的凋亡率的影响。3．通过RT-PCR检测抑制LRPl6表达之后核转录因子．1(B(nuclearfactor-r．B，NF—KB)凋亡相关的下游靶基因的mRNA水平。结果：在依托泊苷或者电离辐射的作用下，通过siRNA转染抑制LRPl6的表达使能够明显抑制HeLa细胞的增殖(正o．05)。同时增加细胞的凋亡率(