造血祖细胞促人大肠癌生长、侵袭和转移的实验研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文造血祖细胞促人大肠癌生长、侵袭和转移的实验研究Humanhematopoieticprogenitorcellspromotecellgrowth，invasionandmetastasisofhumancolorectalcancerinvitroandinvivo课题来源：国家自然科学基金专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员病理学与病理生理学吴小金李学农教授丁彦青教授钟雪云教授张雅洁教授韩慧霞教授邓永键副教授论文评阅人王连唐教授赵彤教授2012年5月15日／IYIIIIlll2lltlFP2IIIIIl5IIIIIIl7

2、lllll3lllllllllJIIl4IJJUl硕士学位论文造血祖细胞促人大肠癌生长、侵袭和转移的实验研究研究背景和目的硕士研究生：吴小金指导教师：李学农摘要结直肠癌(colorectalcarcinoma,CRC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升和年轻化趋势。侵袭和转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程，每一阶段都受多种基因／蛋白的调控，其中肿瘤细胞运动行为的改变和运动能力的增强是其侵袭和转移所必不可少的。因此，寻找有效、特异的转移相关基因并探讨其功能，不仅有利于阐明结直肠癌转移的分子机理，还能为临床诊治、药物筛选及预后判

3、断提供新的靶点。肿瘤细胞和宿主之间的相互作用是肿瘤发生发展的内在因素，肿瘤细胞转移具有一定的器官倾向性，这可能是瘤细胞与特定的器官微环境相互作用的结果。肿瘤转移取决于肿瘤细胞本身的分子特性和其分泌的因子对周围间质细胞的影响，包括血管、结缔组织和免疫细胞等。特殊的肿瘤微环境通过各种调节机制影响着肿瘤细胞的生长发展和侵袭转移。因此，肿瘤转移不只是肿瘤细胞本身的生物学特性及遗传特性所决定，从根本上说是癌细胞与宿主相互作用的结果，宿主甚至起决定性作用。造血祖细胞(hematopoieticprogenitorcell，HPC)是造血组织具有自我复制和分化潜能的原始细胞。对祖细胞表面标

4、志性抗原的初步研究发现，CDl33+细胞较CD34+细胞具有更强的增殖潜能且包含有更高比例的长期培养起始细胞，在正常骨髓微环境条件下CDI33+细胞可能比CD34+细胞具有更强的趋化和迁移能摘要力，CDl33+造血祖细胞可能代表了更原始的造血细胞。脐血或称脐带血，是指婴儿娩出后，残留在脐带和胎盘绒毛血管内的血液。脐血中的造血祖细胞的抗原性较弱；增殖能力强；移植相关的并发症的发生率较骨髓和外周血低，且症状轻；采集保存容易；对供者无任何伤害。因此脐血被认为是极具潜力的新的造血祖细胞来源。造血祖细胞能够通过不同的机制动员进入血液循环，在外周器官组织修复、再生及肿瘤生长等生理和病理过

5、程中均发挥重要作用。有学者发现骨髓来源细胞对于肿瘤血管生成、淋巴管生成及肿瘤间质形成、甚或肿瘤的发生均有着密不可分的关系。又有在动物肿瘤层次的研究初步证实其在肿瘤转移的早期阶段发挥关键作用。VEGFR-1+HPC在肿瘤细胞到达特定器官前提前到达，并为肿瘤细胞的到达以及生长创造一个适宜的微环境即“转移前微生境"。该观点改变了我们对肿瘤转移的传统认识，使我们认识到肿瘤转移不仅仅是肿瘤细胞本身的作用，还包含正常的骨髓起源细胞的再生与聚集。但造血祖细胞在人实体肿瘤的主要作用及机制仍不十分清楚，目前尚未在人类肿瘤模型上得到进一步的证实。本研究重点探讨CDl33+脐血造血祖细胞对低、中、

6、高转移潜能的结直肠癌细胞HCT-116、HT-29、LOVO的体外生存、增殖、侵袭及转移能力的影响。且通过裸鼠体内原位移植实验探讨CDl33+造血祖细胞对低转移潜能大肠癌细胞SW480EGFP+体内转移的影响。通过体外和裸鼠体内实验阐明CDl33+造血祖细胞在不同转移潜能结直肠癌生长、侵袭和转移中的主要生物学功能，为揭示结直肠癌转移机制奠定研究基础，为大肠癌转移的早期诊断和治疗奠定理论基础。研究方法l、CDl33+脐血造血祖细胞的干性维持培养及鉴定由南方医院妇产科提供新鲜脐血标本16例，在脐血采集后4h内，利用人CDl33+免疫磁珠分选系统，分离出CDl33+造血祖细胞，予流

7、式细胞仪分析。采用牛血清白蛋白(BSA)和SCF、TPO、IL．3、IL-6、Fit3Ligand五种细胞因子按10：2．5：l：l：l：l的比例组合的培养基培养细胞8周后，再次予细胞形态学、流Ⅱ硕士学位论文式细胞仪、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞的干性。2、CDl33+脐血造血祖细胞对不同转移潜能结直肠癌细胞中MAP4K4的表达和生物学特性的影响将CDl33+脐血造血祖细胞分别与低、中、高转移潜能的大肠癌细胞HCT-116、HT-29和LOVO均按l：20比例进行直接共趋化培养，通过MTT细胞