永久性缺血脑损伤致血脑屏障紧密连接蛋白损害机制研究

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1、浙江大学硕士学位论文永久性缺血脑损伤致血脑屏障紧密连接蛋白损害机制研究姓名：张根生申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：韩峰20120305浙江大学硕士学位论文中文摘要永久性缺血脑损伤致血脑屏障紧密连接蛋白损害机制研究浙江大学药学院09级硕士研究生导师药理学专业张根生韩峰教授摘要背景：脑卒中(Stroke)是一种由各种诱发因素引起脑内动脉狭窄、闭塞或破裂而造成的脑血液循环障碍性疾病，在我国脑卒中已成为我国第一大致残和第二大致死疾病。脑卒中机制复杂比较复杂，实验模型有局限性，加上以往研发新药的脑保护作用过于单一，导致迄今没有疗效确切的新药用于临床。

2、近年来，随着临床上缺血性脑卒中发病率的增加，迫切需要对其发病机制进行深入研究。近年来专家指出脑血管保护应该予以足够重视，提出了神经血管单元(NeurovascularUnit，NVU)p131概念，强调从整体上研究神经血管单元组分损伤和保护机制。神经血管单元维持着神经元的正常生理功能以及受损神经元的修复。血脑屏斛1铊1】包括血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞、胞外间隙及基底膜。血脑屏障作为神经血管单元的重要部分，它的损害直接影响神经系统内环境的稳定，是缺血性脑卒中发生发展中的重要病理现象。虽然近些年关于血脑屏障损害机制研究很多，众多水解酶参与血脑屏

3、障损伤，但是复杂的机制及各个机制之间的Cross．Talk还不清楚。浙江大学硕士学位论文中文摘要目的：通过构建缺糖缺氧(Oxygen-GlucoseDeprivation，OGD)内皮细胞损伤模型及永久性大脑中动脉缺血(PermanentMiddleCerebralArteryOcclusion，p-MCAO)脑损伤模型模拟体内外血脑屏障(Blood—BrainBarrier，BBB)损害，探索血脑屏障损害病理状态下紧密连接蛋白的变化，并通过药物调控深入探索BBB损伤机制，以期为缺血性脑卒中的临床治疗药物的研发提供实验依据。方法：整体动物水平：1．

4、健康成年SD大鼠40只，雄性，8周龄，麻醉后固定手术板上．用脑血流测定仪测定缺血前脑血流，然后线栓法制作永久性大脑中动脉缺血模型。(1)实验大鼠永久性大脑中动脉缺血后脑血流测定。选择0h，1h，12h，24h时间点测定缺血后脑血流的改变。(2)采用EvansBlue法检测永久性脑缺血后BBB损害情况。22h时尾静脉注射2％伊文氏蓝溶液(EvansBlue，EB)，24h时麻醉，左心室灌流，然后断头取脑，拍照，收集样本，冻存于．80℃，最后进行EB含量测定【24】。(3)免疫印迹法研究BBB损害关联蛋白变化规律。选择0h，1h，2h，6h，12h，2

5、4h时间点断头取脑，放于0．32mol／LSucrose溶液中浸泡5min，然后用脑切片模具切片并收集脑组织时效样本，冻存于．80℃用于后续研究。2．健康成年SD大鼠40只，雄性，8周龄，随机分为Vehicle组、钙调蛋白酶抑制剂组(ALLM组)、基质金属蛋白酶抑制剂组(Batimastat组)和丫．分泌酶抑制剂组(DAPT组)，每组lO只。大鼠侧脑室给药(Vehicle组脑室注射人工脑脊液)，给药半小时后用线栓制作永久性大脑中动脉缺血模型，24h后断头取脑，收集样本。Western-blot及荧光免疫组化方法考察BBB相关蛋白表达的变化，探索BB

6、B损伤机制。IV浙江大学硕士学位论文中文摘要细胞水平：1．取生长良好、状态一致的EA．hy926内皮细胞，随机分为5组(Con组，OGD组，ALLM组，DAPT组，Batimastat组)。提前两小时向内皮细胞中对应加入蛋白水解酶抑制剂ALLM、DAPT和Batimastat，Con组细胞正常培养，OGD组给予二甲亚砜(DimethylSulfoxide，DMSO)，然后将OGD组和给药组进行OGD造模12h。收集样本，Western．blot法检测相关蛋白表达。2．取生长良好、状态一致的EA．hy926内皮细胞，随机分为4组(Con组，DAPT组

7、，OGD12h组，DAPT+OGD12h组)。提前两小时向内皮细胞中对应加入蛋白水解酶抑制剂DAPT，Con组细胞正常培养，OGD12h组给予DMSO，然后将OGD12h组和DAPT+OGD12h组细胞放入密闭罐中OGD造模12h。收集样本，Western-blot法检测相关蛋白表达。激光共聚焦免疫荧光染色法观察紧密连接蛋白表达变化。结果：整体动物水平上，永久性大脑中动脉缺血后出现严重神经血管单元受损(神经血管单元损伤标记物Spectrin和Calcineurin出现活性裂解片段)；受试动物血脑屏障相关的紧密连接蛋白出现低分子量裂解片段，同时观察到

8、zonaoccludens．1(ZO．1)蛋白和Occludin蛋白由胞膜向胞浆移位；在永久性缺血受试动物上观察到Calp