血管紧张素ⅱ促进小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞的机制研究

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1、浙江大学博士学位论文血管紧张素Ⅱ促进小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞的机制研究姓名：郑筱叶申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：朱建华201203浙江大学博士学位论文中文摘要血管紧张素II促进小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞的机制研究浙江大学医学院博士研究生导师中文摘要内科学(心血管)郑筱叶朱建华本课题共分为三个部分第一部分：小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞的模型建立研究目的：深入了解血管平滑肌细胞(VSMCs)发育及分化的特点对于了解血管疾病的过程非常重要。然而，目前对VS

2、MCs特异分化及终末分化诱因的研究非常有限，原因之一是缺乏一种合适的VSMCs发育模型。胚胎干细胞为早期VSMCs的谱系形成、分化及成熟机制的研究提供了一种有价值的体外模型，而从胚胎干细胞单一、定向分化成为血管平滑肌细胞为将来的进一步研究其分化机制奠定基础。研究方法：将充满活力的小鼠胚胎干细胞D3系种植于IV型胶原包被的培养皿／板上，经过8天的诱导分化，取其中的2、4、6、8天各个点的细胞进行荧光定量PCR及免疫印迹试验，验证其平滑肌标志基因SMA、SM22、calponiIl、SM．MHC的表达水平

3、。研究结果：Ⅳ型胶原成功诱导胚胎干细胞定向分化成为平滑肌细胞，平滑肌标志基因及蛋白可随诱导时间的增加而同步增加，最高峰在第8天．结论：利用Ⅳ型胶原的诱导分化，成功建立起胚胎干细胞单一、定向分化成为血管平滑肌细胞的体外模型，为进一步探讨其分化机制奠定基础．VI浙江人学博{：学位论文中文摘要第二部分：血管紧张素II促进小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞研究目的：体内外实验均发现血管紧张素II不仅仅是一个体液调节因子，它还是一种促血管新生的因子，可以刺激成血管细胞，包括内皮细胞及平滑肌细胞的生长、发育

4、、分化及凋亡。本实验旨在探明AngII在胚胎干细胞分化成为血管平滑肌细胞过程中本身所具有的生理作用。研究方法：采用在Ⅳ型胶原诱导分化过程中最有分化变化的第四天的干细胞，加入不同浓度的AngII刺激(10击．10d4mo儿)48小时后检测平滑肌标志基因SMA、SM22、calpoIlin、SM．MHC的基因及蛋白表达水平．同时对AngnlO母mo儿组及对照组进行免疫荧光的染色比较。此外还分析了AngII(10币．10‘10mo儿)的刺激是否与促进细胞增殖相关的M唧究。研究结果：AngII可以浓度依赖性的

5、刺激上述标志基因的改变，在mRNA水平SMA、SM22、calponin及SM．MHC的刺激最高峰处在lO。9moI／L(p<0．01)，而在蛋白水平SMA、SM22及calponin的峰值在lO母mol／L(p

6、进分化的过程与促进细胞增殖无关．第三部分：血管紧张素u促进小鼠胚胎干细胞定向分化成为血管平滑肌细胞的机制探讨研究目地：本部分通过对AngII细胞外信号通路的探索，重点研究其促进分化过程中的主要参与部分，包括血管紧张素II的受体及磷脂酰肌醇3激酶P13眦t信号通路，同时探讨AngII在转录因子水平对分化调控的可能参与因子．研究方法：IV型胶原诱导分化第四天的胚胎干细胞中，预先加入AngIlI型受体(ATlR)阻断剂氯沙坦(10sanan)、AngIIII型受体(AT2R)阻断剂PDl23319，V¨浙江

7、大学博上学位论文中文摘要及NF．KB抑制剂BAYl1．7082，后给予AngIIlo。9mo儿的刺激，检测平滑肌标志基因蛋白SMA及c甜ponin的改变。P13K／AI(t信号通路研究上，主要通过AngII不同浓度(10’6．10。omol／L)刺激下检测相关的P13K下游磷酸化脂的变化；同时分析P13K阻断剂LY294002作用下平滑肌标志基因蛋白sMA和calponin及磷酸化触的改变。此外在转录水平检测AngII不同浓度(10。6．10domo儿)对平滑肌标志基因SMA及SM22启动子活性的影响

8、，及对相关转录因子NF—KappaB(NF．迎p50，p65)，c-J吼等的作用。关于AngIl促进分化是否涉及炎症相关基因蛋白的表达的验证，是通过检测AngII刺激下(10击．10。10mo儿)两个炎症相关蛋白TNF．a及c．fos的表达来进行。研究结果：AngII(10母mo儿)的促进平滑肌标志基因SMA和calponin表达的作用可以被AngIIl型受体阻断剂losartan所阻断，而非AngIIII型受体阻断剂PDl23319。AngII浓度依赖