氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡过程的microrna表达谱及let-7c的功能研究

《氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡过程的microrna表达谱及let-7c的功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中南大学博士学位论文氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡过程的microRNA表达谱及let--7c的功能研究姓名：秦冰申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：肖波；杨欢20120525博士学位论文中文摘要摘要目的：1．研究氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow．densitylipoprotein，OX．LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)凋亡中microRNA(miRNA)表达谱变化。2．筛选差异表达的miRNA并运用生物信息学方法对其靶基因进行

2、初步预测和功能分析。3．选择差异表达的miRNA之一hsa—let．7c，验证其作用的靶基因并研究其在OX．LDL诱导HUVECs凋亡中的作用和机制。方法：1．体外培养的HUVECs经OX—LDL(50}tg／m1)作用不同时f日q(0—72小时)后AnnexinV．FITC／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率，确定OX．LDL诱导HUVECs凋亡的最佳作用时间，建立OX．LDL诱导HUVECs凋亡的细胞模型。2．以正常培养的HUVECs为对照组，OX—LDL(5099／m1)作用48小时的HUVECs为实验组，采用miRCURYTML

3、NAmiRNA芯片技术筛选显著性差异表达的miRNA。3．我们从15个差异表达的miRNA中选择表达上调最明显的miRNA：miR-142．3p；表达下调最明显并与脂蛋白代谢相关的miRNA：miR-33a；凋亡相关的miRNA：let．7c和miR-365；和动脉粥样硬化可能相关的miRNA：miR-590—5p进行实时荧光定量PCR博士学位论文中文摘要(qRT-PCR)验证。4．利用TargetScan，MICRORNA．ORG和MicroCosmv5三个数据库对筛选出的差异表达的miRNA进行靶基因预测。将预测得到的，靶基因投射

4、到GeneOntology(GO)数据库和KEGGPathway数据库进行GO分析和Pathway显著性分析，研究靶基因的生物学功能。5．选择凋亡相关miRNAlet．7c为进一步研究对象，qRT-PCR法检测OX—LDL致HUVECs凋亡率逐渐升高过程中1et．7c的表达变化。结合文献及生物信息学软件预测的结果提示抗凋亡蛋白Bcl。xl可能是let-7c的靶基因之一。HUVECs转染1et．7cmimics后或转染let一7cinhibitor再经OX—LDL处理48小时后，qRT-PCR和Westernblot分别检测Bcl—xl

5、mRNA和蛋白水平的表达变化。荧光素酶报告基因法来鉴定在HUVECs中Bcl．xl是否为let．7c作用的直接靶基因。6．mⅣECs转染let．7cmimics后或转染let．7cinhibitor再经OX．LDL处理48小时后，采用Caspase一3活性测定和AnnexinV—FITC／PI双染流式细胞术分析HUVECs凋亡率的变化，研究miRNAlet．7c对HUVECs凋亡率的影响。HUVECs共同转染Bcl—xl表达载体和1et一7cmimics，采用Caspase一3活性测定和AnnexinV—FITC／PI双染流式细胞术分

6、析HUVECs凋亡率的变化，研究let．7c是否通过抑制靶基因Bcl．xl的表达而调控HUVECs凋亡。结果：1．建立OX—LDL诱导HUVECs凋亡的细胞模型，确立5099／ml的OX．LDL诱导HUVECs凋亡的最佳作用时间是48小时。II博士学位论文，——!奎鳖—————————————————————————————————————————————————————————一一2．miRCURYTMLNAmiRNA-。+D1--门检钡,,4结果显示OX-LDL诱导HUVECs凋亡过程中miRNA表达谱发生明显的变化，其中有4个m

7、iRNA表达显著上调，分别是hsa．miR一142—3p、hsa—miR-1207—3p、hsa-let．7c和hsa—miR-365；11个miRNA的表达显著下调，分别是hsa—miR．374a、hsa．miR-375、hsa—miR-1197、hsa-miR-429、hsa—miR一222、hsa—miR-18b、hsa—miR-155、hsa—miR一590—5p、hsa-miR-32、hsa—miR-589和hsa—miR一33a。3．我们从15个差异表达的miRNA中选择5个(hsa．miR一142—3p，hsa—miR-

8、33a，hsa-let一7c，hsa—miR一365和hsa—miR一590—5p)采用qRT-PCR验证基因芯片的结果。发现qRT-PCR结果与芯片结果一致，表明miRNA芯片结果可靠。4．利用TargetScan等生