无色孔雀石绿残留快速检测技术的建立及应用

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1、学校代码：10264研究生学号：M090104215上海海洋大学硕士学位论文题目：无色孔雀石绿残留快速检测技术的建立及应用英文题目：EstablishmentandapplicationofRapidDetectionTechnologytodeterminatetheresiduesofleucoMalachiteGreen专业：临床兽医学研究方向：水产动物免疫学姓名：陈力指导教师：杨先乐教授二O一二年四月五日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究

2、工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年

3、解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士论文摘要孔雀石绿（MalachiteGreen，MG）化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式为C23H25ClN2，又名碱性绿、孔雀绿或者中国绿，属三苯甲烷类染料，孔雀石绿在水生动物体内会很快代谢成无色孔雀石绿。孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿成为重大的食品安全隐患。目前，孔雀石绿被我国被列为禁用渔药，世界其他各国，1992年加拿大就已经禁止孔雀石绿及无色孔雀石绿作为渔场杀菌剂；美国政府给出了严格的规定，禁止在食用水产品中检

4、出孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿；2002年6月，欧盟政府颁布了相关法令，禁止在任何渔场中违禁使用孔雀石绿。2002年5月，中国政府将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止孔雀石绿用于所有食品动物的养殖及运输过程。尤其是无色孔雀石绿，其与孔雀石绿相比在水产品中的残留量更多，残留时间较更长，因此，建立水产品中无色孔雀石绿的快速检测技术已刻不容缓具有更加重要的意义。目前无色孔雀石绿的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）等。这些方法操作繁琐、仪器价格昂贵，需要专业的技术人员，而且不适合

5、现场大规模的检测。以免疫学方法为基础的快速检测方法，具有快速、灵敏、价格低廉、适合现场大规模检测等优点，是目前公认最适合作为药物残留检测的快速筛选方法之一。酶联免疫检测试剂盒作为一种快速、灵敏、不需要任何仪器的检测技术可作为无色孔雀石绿的药物残留现场检测的一种重要的初筛手段。本实验通过合成无色孔雀石绿的人工抗原，免疫Balb/c小鼠后，通过采集免疫小鼠的脾脏细胞，利用杂交瘤实验技术制备了可用于检测无色孔雀石绿的单克隆抗体，并利用得到的特异性强的单克隆抗体制备了无色孔雀石绿的酶联免疫检测试剂盒。首先，利用混酸硝化还原法对无色孔雀石绿进行改

6、造，获得氨基无色孔雀石绿(NH2-LMG)；同时，采用结构类似物副品红（PA）,然后采用改进的碳二亚胺（carbodiimide）法制备了2种不同无色孔雀石绿完全抗原记作LMG-BSA和PA-BSA，通过紫外分光光度计扫描、聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳、质谱分析等方法对无色孔雀石绿完全抗原LMG-BSA和PA-BSA进行鉴定。结果表明：紫外扫描都发现了峰的漂移；PA-BSA偶联物质谱图中可观察到分子量为78180的高分子化合物。对比BSA的分子量和PA的分子量，可以判断偶联成功且偶联比率约为37:1，LMG-BSA偶联物质谱图中可

7、观察到分子量为68759的高分子化合物。对比BSA的分子量和NH2-LMG的分子量，可以判断偶联成功且偶联比率约为7:1，利用LMG-BSA和I上海海洋大学硕士论文5PA-BSA免疫小鼠，得到的血清效价均为10以上，表明制备得到的LMG-BSA和PA-BSA偶联物均可以用于孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿人工抗原的制备。将LMG-BSA和PA-BSA偶联物分别免疫5只小白鼠，加强免疫后获得多抗血清，分别采用LMG-OVA和PA-OVA作为包被原进行血清效价测定，结果表明各抗体血5清的效价均高于10。实验中选取血清效价最高的BALB/C小

8、鼠用于细胞融合。采用杂交瘤技术将脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。然后采用间接ELISA以及间接竞争ELISA法对杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，同时利用有限稀释法进行3次亚克隆，最终筛选出4株稳定的可分泌