新型fgfr1抑制剂抗肿瘤作用筛选及机制研究

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1、温州医学院硕士学位论文新型FGFR1抑制剂抗肿瘤作用筛选及机制研究姓名：曹孟华申请学位级别：硕士专业：中药学指导教师：李校堃；梁广；王怡2012-05-22温州医学院硕士学位论文新型FGFRl抑制剂抗肿瘤作用筛选及机制研究摘要目的1．姜黄素类化合物具有多种药理作用，在抗肿瘤方面，不仅可以抑制多种肿瘤细胞的生长，而且体外对血管内皮类细胞也有明显的抑制作用。成纤维细胞生长因子ffGFs)结合和激活相应受体(FGFR)，不仅促进肿瘤细胞的快速异常增殖和肿瘤组织中新生血管的生长，并_[1FGF可介导广谱的抗肿瘤药物耐药性，

2、而肿瘤细胞对化疗药物的抗药性和在转移性肿瘤治疗中化疗的有限疗效是临床上最主要的两个挑战。因此，FGFR被视为肿瘤等疾病的治疗靶标之一而备受关注。本实验室对姜黄素进行结构改造，合成了大量单羰基姜黄素类似物。本文采用体外相关激酶筛选的方法先对化合物进行筛选，得到一批较好的抑制FGFRl及下游信号蛋白磷酸化的化合物，再结合MTT等的方法以期得到不仅具有抗肿瘤活性，并且有较好的抑制血管内皮细胞活性的新型的FGFRl抑制剂。2．研究筛选得到的活性化合物对H460肿瘤细胞和HUVEC细胞增殖的影响，并做量效关系及药物作用时效研

3、究。3．研究活性化合物对两种细胞中FG-FRl及下游蛋白磷酸化的抑制。4．研究活性化合物对HLTVEC细胞周期及凋亡的作用。5．研究活性化合物在CAM实验中抑制新生血管生成作用及探讨化合物进一步的动物肿瘤模型实验方案及应用前景展望。方法1．．姜黄素在临床应用中存在有代谢过快、半衰期短、血药浓度低、生物利用度低等缺陷，因此，我们课题组设计合成了一系列可以改善这些缺陷的不含有p．二酮基团的姜黄素类似物。2．体夕bFGFRl激酶磷酸化抑制检测对合成的一批姜黄素类似物送样检测F(诳R1磷酸化抑制效果，得到少数抑制活性较好的

4、化合物。3．抗肿瘤活性筛选体外培养A549，H460，U251，P815细胞，采用MTT法检测受测化合物对上述四种FGFRl高表达肿瘤细胞的增殖抑制作用。4．量效关系研究根据上述MTT的结果，得到活性较好的1个化合物，送样检测其不仅对FGFR磷酸化有抑制作用，且对KDR(VEGFR2)的磷酸化也有很好的抑制，故用MTT温州医学院硕士学位论文法选择HUVEC细胞研究活性化合物对其增殖抑制作用，包括量效关系及时效关系。5．检测化合物L16H50对FGFRl及其下游蛋白磷酸化影响Westernblot法检测化合物对H46

5、0及HUVEC细胞中FGFRl、AKT、ERK蛋白磷酸化的抑制作用。6．检测细胞周期、凋亡情况化合物处理HUVEC细胞，用PI及AnnexinV／PI染色试剂盒染色，流式细胞术检测细胞周期、凋亡的情况。7．C砧Ⅵ实验检测化合物抑制新生血管生成进行鸡胚实验，检测化合物体内影响血管生成的作用。8．检测KDR(VEGFR2)磷酸化Westernblot法检测VEGH匕磷酸化水平。结果1．MTT结果显示姜黄素类似物L16H50可抑制上述4种肿瘤细胞和HUVEC细胞的增殖，并具剂量依赖性，在浓度为1rtM时，对细胞生长的抑制

6、作用比较明显且对正常细胞系毒性小。2．Westernblot分析显示，上述化合物可明显抑制H460及HUVEC细胞中FGFRl及相关信号蛋白的磷酸化。。，3．流式细胞检测显示，与对照组相比，化合物L16H50可明显抑制琢ⅣEC细胞周期和诱导其凋亡。4．CAM实验结果及KDR磷酸化水平检测表明，化合物L16H50可有效抑制内皮细胞中圈)R的磷酸化，在体内实验中可有效抑制新生血管的发生租生长。结论1．通过MTT实验，发现所合成姜黄素类似物中，有一些活性较好，可以抑制肿瘤细胞的增殖，并且活性较好的化合物L16H50不仅有

7、抗肿瘤活性而且可以有效抑制内皮细胞的增殖，这两种作用都具有剂量依赖性。2．通过检测FGFRl及相关信号分子的磷酸化水平，推断其抗肿瘤分子机制。3．通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡及对关键的凋亡相关分子caspase3的量的变化进行检测，进一步推断其抗肿瘤活性的分子机制。4．通过CAM实验及检测KDR(VEGFR2)磷酸化水平推断化合物L16H50具有较好的抑制肿瘤组织中新生血管的发生和生长。关键词姜黄素类似物；抗肿瘤；抑制血管生成；FGFRl；VEGFR2；受体磷酸化。7温州医学院硕士学位论文AnovelFGFR1

8、inhibitorsantineoplasticeffects’screeningandmechanismresearchObjective1．Curcumincompoundshavemanypharmacologicalactions，notonlycaninhibitthegrowthofmultipletumorcells，andinvitroals