具有肝实质细胞线粒体靶向功能的纳米递释系统的分析

《具有肝实质细胞线粒体靶向功能的纳米递释系统的分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、摘要恶性肿瘤的防治始终是生命科学研究领域的一个难点。本论文根据肿瘤局部和线粒体的生理特点要求，设计了两种新型的多功能高分子材料N-甘草次酸-酸敏感桥-聚乙二醇-壳聚糖衍生物(N-glycyrrhetinicacid(GA)-polyethyleneglycol(PEG)-chitosanderivatives,NGPC)和N-季铵-壳聚糖衍生物(N-quaternaryammonium-chitosanderivatives,NQC)，并以此为构筑单元，以马钱子碱（Brucine）为模型药物，构建新型多功能纳米药物递释系统（MNPs）。在该系统中，聚乙二醇具有较长的亲水链，可以

2、在纳米粒周围形成水化层，减少血液中巨噬细胞的吞噬，延长递释系统在体内循环时间，同时对季铵正离子起屏蔽作用，减少其在生理环境中的毒性。水化层表面的甘草次酸具有肝实质细胞主动靶向的功能，当载体系统被内吞进入到肝细胞的内涵体/溶酶体后，由于微环境pH值的降低，纳米粒表面的水化层随着GA-PEG脱落而消失，裸露出带季铵正离子的正电荷壳聚糖纳米粒，同时亚胺基团产生强烈的质子海绵效应，逃逸出溶酶体，通过正负电荷的吸引浓集于线粒体表面，释放出药物，抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。在课题组前期研究的基础上，本课题首先用离子交联法制备了载马钱子碱的壳聚糖多功能释系统(Brucine/MNPs

3、)，以及分别由NGPC和NQC为构筑材料制备的参比制剂(Brucine/NGPC-NPs和Brucine/NQC-NPs),对其外观形态、粒径分布、Zeta电位、包封率、载药量、水化层厚度、体外释放及质子海绵效应等理化性质进行了详细考察。结果显示，Brucine/MNPs的包封率为68.53±2.42%，载药量为6.01±0.27%，粒径为185.3±6.9nm，并且Brucine/MNPs保持着与空白MNPs相当的pH响应的电荷翻转能力和内体逃逸能力，透射电镜照片下观察Brucine/MNPs为球形，分散较好，与纳米粒径仪测定粒径基本相当。体外释放表明，Brucine/MNP

4、s在pH7.4和pH4.5下的释放行为基本一致，都具有缓释作用。以溶液剂和Brucine/NQC-NPs作为参比制剂，对Brucine/NGPC-NPs和IBrucine/MNPs在小鼠体内的组织分布行为进行了考察，以相对摄取率(Relativeratio,Re)和峰浓度比(Concentrationratio,Ce)等为评价指标，评价其对肝组织的靶向性。研究结果显示，Brucine/NGPC-NPs和Brucine/MNPs具有较强的肝靶向性，以AUC0-t计算，二者的Re值分别是Brucine/NQC-NPs的4.89倍和5.02倍，Ce值分别是Brucine/NQC-NP

5、s的2.49倍和2.57倍，其肝靶向效率和相对靶向效率也都显著提高，具有较强的肝组织选择性。以人肝癌HepG2细胞为细胞模型，考察浓度、时间、温度对其细胞摄取的影响，并对其细胞摄取机制进行初步探讨。结果发现，HepG2细胞对各制剂的摄取均具有时间和浓度依赖性，且对Brucine/NGPC-NPs和Brucine/MNPs的摄取明显强于Brucine/NQC-NPs和Brucinesolution。为了进一步研究其被细胞内化的机制，考察甘草次酸和各种内吞抑制剂对细胞摄取的影响，发现HepG2细胞对Brucine/MNPs的摄取过程需要转运蛋白的参与，且主要通过表面的甘草次酸配体与

6、肝细胞表面的甘草次酸受体结合的方式来增加在靶细胞的浓集，之后通过网格蛋白介导的内吞路径被细胞内化进入细胞内涵体/溶酶体。采用激光共聚焦显微镜定性观察Brucine/NGPC-NPs、Brucine/NQC-NPs和Brucine/MNPs在细胞内的转运过程，并结合HPLC检测HepG2细胞线粒体内Brucine的累积量，定量考察Brucine/MNPs的线粒体靶向作用。研究表明，与NGPC-NPs和NQC-NPs相比，MNPs具有显著的内涵体/溶酶体逃逸能力和线粒体靶向作用。考察了四种Brucine制剂的体外抗肿瘤活性，并对其促肿瘤细胞凋亡机制进行了初步探讨，结果表明，在各给药

7、浓度下，载药纳米制剂均表现出了较强的杀死肿瘤细胞的能力，且Brucine/MNPs明显强于其它制剂，细胞总凋亡率增加，结合透射电镜观察和流式细胞仪发现，线粒体出现了明显的肿胀和变形，并伴随着线粒体膜电位的降低和细胞色素C的释放，且载体的引入并没有改变细胞周期的变化，细胞周期仍被阻滞在G2期。上述结果表明，多功能纳米载药系统不仅能够促进肿瘤细胞的摄取，还能有效地实现药物的细胞内转运，促进肿瘤细胞的凋亡，增强药物对肿瘤细胞的杀伤力。建立Heps异位荷瘤小鼠模型，考察MNPs的体内抗肿瘤药效学，结