肉鸡铬代谢相关mirna的鉴定与分析

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1、华中农业大学硕士学位论文肉鸡铬代谢相关miRNA的鉴定与分析姓名：潘英姿申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：戴汉川；剂广海201206肉鸡铬代谢相关miRNA的鉴定与分析捅要铬(Cr)作为一种必需微量元素，在蛋白质合成、糖类代谢和脂类代谢等中都发挥重要作用。三价铬离子(Cr3+)是葡萄糖耐量因子(GTF)的活性成分，它协同GTF增加胰岛素的活性进而参与机体组织的各项功能代谢。微小RNA(microRNAs，简称miRNAs)是真核生物中一类具有转录后调控功能的非编码RNA，与蛋白质代谢和骨骼肌分化密切相关。目前，与鸡铬代谢相关的miRNA尚未见诸报道。本研究拟通过动物试

2、验筛选影响肉鸡骨骼肌蛋白质代谢的铬剂量，采用Solexa测序技术并结合实时荧光定量PCR技术综合筛选鸡铬代谢相关miRNA以获得差异表达的miRNA。本研究主要结果如下：1、288只1日龄的爱拔益加(AA)肉仔鸡随机分成4个处理组，每个处理6个重复，每个重复12只鸡。4个处理组的基础日粮中分别添加0mg／kg(对照组)、0．4mg&g、2．0mg&g或10．0mg&g吡啶羧酸铬(CrPic)。以每个重复为单位，分别于21d和42d称重和结料，并以每个重复为单位随机抽取一只肉鸡采集血样检测蛋白质代谢相关指标。结果表明，21d时，各组的平均日增重、平均日采食量和料肉比均差异不显著(

3、P>0．05)。42d时，10．0mg／蚝CrPic组肉鸡的平均日采食量显著增加(P<0．05)；42d时，2．0mg&g和10．0mg&gCrPic组的血清总蛋白含量同对照组相比差异显著升高(P<0．05)；10．0mg&gCrPic组的肉鸡血清葡萄糖浓度显著降低(P<0．05)。10．0mg&gCrPic组21d和42d的肉鸡血清甘油三酯浓度均显著降低(P

4、c组和对照组肉鸡骨骼肌的小RNA文库进行了测序，结果分别获得高达12．7和12．1百万条短序列读数。对miRNA的长度进行分析，结果发现大部分的小RNAs分布在20---23nt，其中长度为22nt的序列约为70％～80％。对长度为20～24nt的miRNAs的首位碱基进行了分析，结果发现长度为22nt的miRNA其首位碱基大部分为尿嘧啶。通过BLASTN搜索工具利用Rfam和Genbank数据库来注释测序得到的小RNA序列，肉鸡骨骼肌中的miRNAs占小RNAs总数的80％以上，但是miRNAs只占小RNA种类的1％～2％。使用SOAP软件将已知序列同miRBase(Rele

5、ase15．0)中鸡的miRNAs前体序列进行比对，分别鉴定了198和179个保守的miRNA／miRNA*。使用Mireap软件结果共发现28和17个新的候选miRNA／miRNA*。从以上miRNAsl华中农业大学2012届硕士学位论文中共鉴定出57个表达差异显著的miRNAs。3、采用实时荧光定量PCR法对57个miRNAs中的6个表达上调(gga-let-7b、gga-miR-103、gga-miR-140水、gga-miR-181a、gga—miR-206和gga—miR-30d)并1]2个表达下调(gga-miR-301b-3p和gga-miR-1682)的miRN

6、A进行了鉴定，结果表明所有miRNA的表达都差异显著，这一结果同Solexa测序结果一致。4、miRNA主要通过与靶mRNA3’端非编码区完全或部分互补结合，使靶mRNA降解或抑制蛋白质的翻译合成。通过生物信息学方法，我们预测了miRNA的靶基因，转录因子EIF4E和胰岛素生长因子I(IGFl)被预测为gga-miR一206的靶基因；胰岛素生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)并I]磷酸肌醇3激酶调控亚基3(PIK3R3)被预测为gga-miR-181a的靶基因；PIK3R3同时被预测为gga-miR-103的靶基因；P13K相关激酶SMGl被预测为gga-miR-14

7、0木的靶基因。结果表明，预测的靶基因可能同相应的miRNA一起对肉鸡骨骼肌蛋白质的合成发挥重要作用。本研究结果显示，有机铬对肉鸡骨骼肌miRNA表达调控起一定的作用，10．0mg／kgCrPic显著影响肉鸡骨骼肌miRNA的表达谱。本研究为丰富鸡miRNA信息和开展鸡miRNA研究积累了新的资料，也为有机铬营养调控的分子机制研究提供了新的思路。关键词：microRNAs；肉鸡；Solexa测序；实时荧光定量PCR；吡啶羧酸铬肉鸡铬代谢相关miRNA的鉴定与分析AbstractChromium