影响鸡肌内脂肪沉积相关miRNA的筛选与鉴定

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1、I分类号：密级：学号：2015201602单位代码：10759石河子大学硕士学位论文影响鸡肌内脂肪沉积相关miRNA的筛选与鉴定学位申请人杨娴婧指导教师孙杰副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传资源利用与分子育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年11月ScreeningandIdentificationofmiRNAsAssociatedwithIntramuscularFatDepositioninChickensADissertationSubmittedtoShihez

2、iUniversityInFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByYangXianjing(AnimalGeneticandBreeding)DissertationSupervisor:SunJieNov.2018Xinjiang,shihezi,China本研究由国家自然科学基金（31660654）——《家鸡肉质性状差异表达基因、miRNA的筛选及鉴定》资助完成摘要目的：肌内脂肪（IMF）作为影响肌肉风味的重要物质，其含量对肉质的影响极为显

3、著，是评价肉制品优劣的重要指标。但目前对于鸡胚胎发育早期IMF沉积相关的miRNA及其靶基因的研究较少。本研究以胚胎发育早期的玫瑰冠鸡和科宝鸡腿肌为研究对象，采用高通量测序技术获得与IMF沉积相关的关键miRNA及其靶基因，并研究其涉及的通路及生物学过程，以期探明肌内脂肪（IMF）对肌肉风味调控的分子机理，利用miRNAs靶向干预IMF沉积相关基因，为提高肌肉风味研究提供新思路。方法：（1）采用索氏提取法、高效液相色谱法、试剂盒法分别测定两种鸡肌肉中肌内脂肪、肌苷酸和氨基酸、还原糖和硫胺素的含量；（2）通过对两种鸡肌肉压片的组织

4、学观察，确定两种鸡腿肌和胸肌脂滴开始沉积的时间点；（3）构建两种鸡腿肌的小RNA文库，并通过生物信息学分析方法对测序结果进行分析、用Real-time-qPCR验证库的可靠性；（4）采用miRanda、PITA和RNAhybrid软件预测gga-miR-3532-5p的靶位点，并用双荧光素酶报告基因系统对其与靶基因的靶向关系进行鉴定。结果：（1）玫瑰冠鸡的总氨基酸、必需氨基酸总量、鲜味氨基酸总量均高于科宝鸡（P<0.05）；玫瑰冠鸡的肌苷酸（IMP）和矫正肌苷酸（IMPc）含量均高于科宝鸡；玫瑰冠鸡的硫胺素、还原糖含量高于或者持

5、平于科宝鸡；玫瑰冠鸡的肌内脂肪（IMF）含量大部分高于科宝鸡；总体来说，玫瑰冠鸡肉品质风味较科宝鸡更优。两种鸡母鸡的五种风味物质含量部分高于公鸡。两种鸡肌肉IMF含量随着日龄的增长部分呈上升趋势。（2）两种鸡腿肌均在胚胎发育第7天开始有脂滴沉积，胸肌均在胚胎发育第8天开始有脂滴沉积，腿肌发育早于胸肌；肌肉中脂滴沉积随胚龄增加呈―波浪状‖变化趋势；玫瑰冠鸡脂滴沉积量大于科宝鸡，但沉积速率低于科宝鸡。（3）miRNA测序结果发现：玫瑰冠公鸡的腿肌vs科宝公鸡的腿肌（MGTvsKGT）库共得到差异表达显著的miRNAs306个（其中1

6、54个上调、152个下调），包括已知miRNAs273个，新预测miRNAs33个；玫瑰冠母鸡的腿肌vs科宝母鸡的腿肌（MMTvsKMT）库共得到差异表达显著的miRNAs335个（其中171个上调、164个下调），包括已知miRNAs286个，新预测miRNAs49个。GO和KEGG通路分析显示，差异表达的miRNA主要涉及胚胎发育过程和PPAR信号通路（PPARsignalingpathway）等肌内脂肪沉积相关的信号通路。对库中6个差异表达显著miRNA的qRT-PCR验证结果与高通量测序结果一致。（4）筛选到与肌内脂肪沉

7、积相关的gga-miR-3532-5p及其靶基因FABP5，通过双荧光素酶报告基因鉴定显示，gga-miR-3532-5p极显著的抑制了FABP5-3’-UTR区的报告基因活性，使荧光素酶活性下调19.2%（P<0.01）。说明gga-miR-3532-5p与FABP5基因存在靶向关系，并抑制其表达。结论：（1）玫瑰冠鸡的营养价值及肌肉风味优于科宝鸡，且母鸡均稍优于公I鸡。（2）腿肌在胚胎发育第7天开始有脂滴沉积，胸肌在胚胎发育第8天开始有脂滴沉积，胚胎发育第7天可以作为研究脂滴开始沉积的关键点。（3）两种鸡腿肌的miRNA文库

8、构建成功，分析获得了表达差异显著的miRNAs，其中MGTvsKGT库306个，MMTvsKMT库335个。（4）证明了FABP5是gga-miR-3532-5p的靶基因，推测gga-miR-3532-5p可能通过作用于FABP5基因，参与IMF沉积负调控。关键