番茄APX、AOBP、AO等Vc代谢相关基因的功能初步鉴定与分析

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1、华中农业大学硕士学位论文番茄APX、AOBP、AO等Vc代谢相关基因的功能初步鉴定与分析姓名：舒文波申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：李汉霞;谢从华20060401华中农业大学2006届硕上学位论文中文摘要抗坏血酸即维生素C，是植物和大多数动物体内合成的一类含量丰富的己糖内酯化合物。它在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用，是保证人类健康所必需的营养物质；同时还与植物细胞的分裂、伸长和植株生长有关。少数动物f包括人类)自身已经丧失了合成能力，必须从食物中摄取，而植物是提供抗坏血酸的主要来源。抗坏血酸及其代谢

2、相关酶类在清除活性氧方面的作用使得抗坏血酸在植物抵抗环境胁迫中也起着重要作用。RNAi技术作为基因功能研究的一种非常有效手段得到了广泛的应用。通过RNAi技术调控植物抗坏血酸生物代谢相关酶基因的表达，改变某些代谢酶类的活性，获得具有应用潜力的高含量抗坏血酸的番茄材料，从而增加植物产品的营养价值，增强植物对逆境的抗性是可行的。番茄是一种世界上广为栽培的高营养、高价值的蔬菜作物，然而，目前番茄抗坏血酸生物代谢途径中大部分基因的功能都不太明确，对其进行转基因调控的报道几乎没有。因此，本研究以番茄这一重要的蔬菜作物为材料，

3、鉴定抗坏血酸生物代谢相关酶基因，即抗坏血酸氧化酶启动子结合蛋白、抗坏血酸氧化酶和2个抗坏血酸过氧化酶基因，将其构建到植物RNAi研究载体pHGRV中，通过农杆菌介导法获得转基因植株，分析转基因番茄的植株生长、生理生化及抗氧化逆境等特性，以期获得具有应用价值的抗坏血酸含量增加的番茄材料。获得的主要结果如下：1-分别构建了抗坏血酸氧化酶AO(Ascorbateoxidase，AY971876)和抗坏血酸过氧化物酶t4PX(Ascorbateperoxidase，AF413573)这两个基因的RNAi植物研究载体；利用农

4、杆菌介导的遗传转化方法将它们成功导入番茄品种ZS5#中。2．获得卡那霉素抗性转化植株11棵，PCR检测和Southernblot结果表明，外源基因已整合到番茄基因组中，其拷贝数1．5个不等。3．测定了抗坏血酸氧化酶AO(Ascorbateoxidase，AY971876)和抗坏血酸过氧化物酶tAPX(Ascorbateperoxidase，AF413573)T1代RNAi植株抗坏血酸含量以及抗坏血酸氧化酶、抗坏血酸过氧化酶的活性，发现T1代转基因植株果实抗坏血酸含量大部分得到提高，最高分别增加了0．59倍、1．16

5、倍；相应的抗坏血酸氧化酶，抗坏血酸过氧化酶的活性大部分降低，最低分别减少了53．59％、55．23％。且各转基因株系间存在一定差异。4．测定了抗坏血酸氧化酶启动子结合蛋白AOBP(Ascorbateoxidasepromoter-bindingprotein，TCl55602)和抗坏血酸过氧化物酶cAPX(Ascorbateperoxidase，TCl54675)T2代RNAi植株抗坏血酸含量以及抗坏血酸氧化酶、抗坏血酸过氧化酶的活性，发现T2代转基因植株果实抗坏血酸含量大部分得到提高，最高分别增加了2．21倍、1

6、．4倍；相应的抗坏血酸氧化酶，抗坏血酸过氧化酶的活性大部分有所降低，最低分别减少了74．39％、92．55％。且各株系间存在一定差异。番茄Vc代谢相关的APX、AOBP、AO基因功能初步鉴定与分析5．利用RT-PCR技术测定不同单株叶片表达量，结果各基因的表达量与酶活一致；利用番茄表达数据库(TomatoExpressionDatabase，TED)分析了番茄抗坏血酸生物代谢相关基因的数字表达谱，初步证明有3个基因在果实中高效表达。而tAPX基因没有在果实中发现表达。6．对4个转基因植株后代的抗氧化逆境特性进行了初

7、步观察，结果表明AOBP基因和2个APX基因的RNAi的转基因植株后代的抗旱性、耐盐性和对除草剂(百草枯)的抗性有一定程度的降低，但AO基因的RNAi转基因植株后代抗性却上升。关键词：番茄(LycopersiconesculentumMill．)；抗坏血酸；RNA干涉；基因表达；遗传转化；基因调控llAbstractL-ascorbicacid(ASA)，alsonamedvitaminC，ahexoselactone，playsallextensiveroleinplantandmostanimals．Ithas

8、amultitudeoffunctionsinorganisms，andisallessentialcomponentofhumannutrition；moreover,isinvolvedintheprocessofcelldivision，cellexpansionandplantgrowth．Butsomeanimalsincludinghumansl