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时间:2019-02-19
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1、河北医科大学硕士学位论文全反式维甲酸对两种不同来源SH--SY5Y细胞的影响姓名:王晓荣申请学位级别:硕士专业:人体解剖与组织胚胎学指导教师:曹翠丽201203中文摘要全反式维甲酸对两种不同来源SH.SYSY细胞的影响摘要目的:研究全反式维甲酸(RA)对两种不同来源的SH。SY5Y细胞系的诱导分化作用,并鉴定其诱导分化效率,为进一步探讨神经细胞分化机制选择最适合的S冀.SY5Y细胞系亚型。方法:SH.SY5Y细胞系的来源:一株SH.SY5Y细胞系由北京大学医学部干细胞中心惠赠,一株SH.SY5Y细胞
2、系由河北师范大学生命科学院惠赠。将两种不同来源的SH.SY5Y细胞系在同一条件下分别做如下处理:l细胞培养:SH.SY5Y细胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基,置于37℃,5%C02、饱和湿度的空气培养箱中常规培养。2细胞传代:待SH。SYSY细胞的融合度达到。黼90%时,用胰蛋白酶/EDTA消化液,于37℃条件下消化3~5分钟,弃掉消化液,加入含血清的DMEM培养基终止消化。离心5分钟(1000转/分钟),去上清。用含lO%小牛血清的DMEM培养液重悬
3、细胞,按l:2传代。送37。C,5%C02、饱和湿度的空气培养箱中继续培养。3生长曲线测定:把两种不同来源的SH.SY5Y细胞分别分为对照组和处理组,各取对数生长期的细胞,以1×105个/L浓度接种于24孔培养板,接种24h后,空白对照组换新鲜含10%FBS的DMEM培养液培养,处理组培养液中加入109mol/L的RA,连续培养5d,予加RA后ld、3d、5d,用苔盼蓝排除法计数两组活细胞,绘制细胞生长蓝线。4细胞同步化处理:①正常对照:传代后24h换正常传代用培养液,培养24h后收细胞。②饥饿疗法
4、:传代后24h换含1%FBS的DMEM培养液,培养24h后收细胞。用流式细胞仪检测细胞周期的变化,并用X2检验检测其构成比有无差异。5细胞分组:将不同来源的SH.SY5Y细胞系分别分成四组,A组是空白对照组,细胞在含10%FBS的DMEM培养基中培养,每2天更换一次培养液;B组是RA诱导ld组,传代后24h,换含10%FBS新鲜配置的培养基加入109mol/LRA继续培养ld;C缀是RA诱导3d组,传代后中文摘要24h换新鲜配置的培养基加入10pmol/LRA继续培养3d;D组是RA诱导5d组,传代
5、后24h换新鲜配置的培养基加入109mol/LRA继续培养5d。6细胞形态学观察:将SH.SY5Y细胞以lxl05的密度接种于25ml培养瓶中,A、B、C、D组同时接种,传代后24h及加入RA处理后ld、2d、3d用倒置显微镜观察细胞形态和分化情况,拍照记录用于比较。根据Sandquist法,细胞分化的标志为一个或一个以上轴突长度直径延伸至胞体2倍以上。7免疫荧光化学检测NF、MAP.2在细胞分化过程中的表达:取空白对照组和RA诱导5d组,用免疫细胞化学检测NF、MAp.2在SH.SY5Y细胞向神经
6、元分化过程中的表达情况。8结果分析:采用SPSS19.0统计软件进行,所有数据以均数4-标准差来表示。对各组间数值采用方差分析和t检验。确定P<0.05为有显著性差异。结果:lRA对SH.SY5Y细胞增殖的影响:细胞生长曲线显示了各组活细胞计数结果:来源予河北师范大学生命科学院的SH.SY5Y细胞株其对照组平均倍增时闻为36.12d,时;处理组平均倍增时间为42.63d'时,其生长速度减慢,抑制率为37.24%。来源于北京大学医学部干细胞中心的SH.SY5Y细胞株其对照组平均倍增时间为38.12d'
7、时;处理组平均倍增时间为49.7l小时,其生长速度减慢,抑制率为40.39%。2细胞同步化处理:流式细胞检测分析结果显示,SH.SY5Y细胞经饥饿处理24h后,G2/M%+S%下降了13.25‰增殪期的细胞比例明显少于正常培养组,其差异有显著性(矽<馥甜),此时,处于Gl期的细胞比例达到81.59%,大量细胞达到同步化。3分化对SH.SY5Y细胞形态的影响:未分化的两种SH.SY5Y细胞均贴壁生长,胞体均呈现出不规则的圆形、梭型、多边形等形态,大部分细胞有多个短突起,胞核大,核仁清晰。但北京大学医学
8、部干细胞中心惠赠的SH.SY5Y细胞胞体比河北师范大学生命科学院惠赠的SH.SY5Y细胞胞体稍小。经RA处理ld后,河北师范大学生命科学院惠赠的SH.SY5Y细胞形态发生变化,从细胞的两端伸出树突样突起,细胞呈极性状,3d后分化形态曼明显,胞体变小,细胞两端伸出的突起变成细而长的轴突样突起,达中文撼要第5d时突起长度加长并可见部分突起交织威网状。=l艺京大学医学部干细胞中心惠赠的SH.SYSY细胞分化程度更明显,不仅细胞两端的突起伸展更加明显,而且形成的更多的突起在细
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