全反式维甲酸对两种不同来源sh-sy5y细胞的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文全反式维甲酸对两种不同来源SH--SY5Y细胞的影响姓名：王晓荣申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：曹翠丽201203中文摘要全反式维甲酸对两种不同来源SH．SYSY细胞的影响摘要目的：研究全反式维甲酸(RA)对两种不同来源的SH。SY5Y细胞系的诱导分化作用，并鉴定其诱导分化效率，为进一步探讨神经细胞分化机制选择最适合的S冀．SY5Y细胞系亚型。方法：SH．SY5Y细胞系的来源：一株SH．SY5Y细胞系由北京大学医学部干细胞中心惠赠，一株SH．SY5Y细胞

2、系由河北师范大学生命科学院惠赠。将两种不同来源的SH．SY5Y细胞系在同一条件下分别做如下处理：l细胞培养：SH．SY5Y细胞用含10％胎牛血清、100U／ml青霉素、100U／ml链霉素的DMEM培养基，置于37℃，5％C02、饱和湿度的空气培养箱中常规培养。2细胞传代：待SH。SYSY细胞的融合度达到。黼90％时，用胰蛋白酶／EDTA消化液，于37℃条件下消化3～5分钟，弃掉消化液，加入含血清的DMEM培养基终止消化。离心5分钟(1000转／分钟)，去上清。用含lO％小牛血清的DMEM培养液重悬

3、细胞，按l：2传代。送37。C，5％C02、饱和湿度的空气培养箱中继续培养。3生长曲线测定：把两种不同来源的SH．SY5Y细胞分别分为对照组和处理组，各取对数生长期的细胞，以1×105个／L浓度接种于24孔培养板，接种24h后，空白对照组换新鲜含10％FBS的DMEM培养液培养，处理组培养液中加入109mol／L的RA，连续培养5d，予加RA后ld、3d、5d，用苔盼蓝排除法计数两组活细胞，绘制细胞生长蓝线。4细胞同步化处理：①正常对照：传代后24h换正常传代用培养液，培养24h后收细胞。②饥饿疗法

4、：传代后24h换含1％FBS的DMEM培养液，培养24h后收细胞。用流式细胞仪检测细胞周期的变化，并用X2检验检测其构成比有无差异。5细胞分组：将不同来源的SH．SY5Y细胞系分别分成四组，A组是空白对照组，细胞在含10％FBS的DMEM培养基中培养，每2天更换一次培养液；B组是RA诱导ld组，传代后24h，换含10％FBS新鲜配置的培养基加入109mol／LRA继续培养ld；C缀是RA诱导3d组，传代后中文摘要24h换新鲜配置的培养基加入10pmol／LRA继续培养3d；D组是RA诱导5d组，传代

5、后24h换新鲜配置的培养基加入109mol／LRA继续培养5d。6细胞形态学观察：将SH．SY5Y细胞以lxl05的密度接种于25ml培养瓶中，A、B、C、D组同时接种，传代后24h及加入RA处理后ld、2d、3d用倒置显微镜观察细胞形态和分化情况，拍照记录用于比较。根据Sandquist法，细胞分化的标志为一个或一个以上轴突长度直径延伸至胞体2倍以上。7免疫荧光化学检测NF、MAP．2在细胞分化过程中的表达：取空白对照组和RA诱导5d组，用免疫细胞化学检测NF、MAp．2在SH．SY5Y细胞向神经

6、元分化过程中的表达情况。8结果分析：采用SPSS19．0统计软件进行，所有数据以均数4-标准差来表示。对各组间数值采用方差分析和t检验。确定P<0．05为有显著性差异。结果：lRA对SH．SY5Y细胞增殖的影响：细胞生长曲线显示了各组活细胞计数结果：来源予河北师范大学生命科学院的SH．SY5Y细胞株其对照组平均倍增时闻为36．12d,时；处理组平均倍增时间为42．63d'时，其生长速度减慢，抑制率为37．24％。来源于北京大学医学部干细胞中心的SH．SY5Y细胞株其对照组平均倍增时间为38．12d'

7、时；处理组平均倍增时间为49．7l小时，其生长速度减慢，抑制率为40．39％。2细胞同步化处理：流式细胞检测分析结果显示，SH．SY5Y细胞经饥饿处理24h后，G2／M％+S％下降了13．25‰增殪期的细胞比例明显少于正常培养组，其差异有显著性(矽<馥甜)，此时，处于Gl期的细胞比例达到81．59％，大量细胞达到同步化。3分化对SH．SY5Y细胞形态的影响：未分化的两种SH．SY5Y细胞均贴壁生长，胞体均呈现出不规则的圆形、梭型、多边形等形态，大部分细胞有多个短突起，胞核大，核仁清晰。但北京大学医学

8、部干细胞中心惠赠的SH．SY5Y细胞胞体比河北师范大学生命科学院惠赠的SH．SY5Y细胞胞体稍小。经RA处理ld后，河北师范大学生命科学院惠赠的SH．SY5Y细胞形态发生变化，从细胞的两端伸出树突样突起，细胞呈极性状，3d后分化形态曼明显，胞体变小，细胞两端伸出的突起变成细而长的轴突样突起，达中文撼要第5d时突起长度加长并可见部分突起交织威网状。=l艺京大学医学部干细胞中心惠赠的SH．SYSY细胞分化程度更明显，不仅细胞两端的突起伸展更加明显，而且形成的更多的突起在细