非融合绿色荧光蛋白标记ev71型人肠道病毒的构建

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1、非融合绿色荧光蛋白标记EV71型人肠道病毒的构建耿磊窦惮王清路齐鲁巨药学院摘要：目的构建非融合绿色荧光蛋口(EGFP)标记的肠道病毒71型(EV71),为EV71抗病毒机制研究及抗病毒药物的筛选提供方法。方法取野生型病毒EV71,在EV71基因组的3D蛋白编码区后添加HBV的link序列，将EGFP基因连入link与EV71型病毒3'非翻译区之间，构建EGFP标记的EV71病毒基因组，并转染横纹肌瘤RD细胞以获得EV71-1ink-EGFP重组病毒。采用PCR方法鉴定重组病毒中link、EGFP位置。感染RD细胞后24、48、72、96、120、144和168h时收获病毒，采用组织半数

2、感染量法测定病毒滴度，绘制病毒生长曲线，比较重组病毒与野生型病毒的生长动力学。RT-PCR测定EGFP转录表达。将重组病毒感染RD细胞后72h裂解，采用Westernblotting法检测RD细胞中GFP、Pl蛋白的表达情况。重组病毒感染RD细胞后，经过13轮传代，Westernblotting法检测EGFP基因稳定性。结果RD细胞内表达较强的GFP荧光，病毒感染细胞后病毒的mRNA正常表达，重组病毒中link序列、EGFP基因链接位置正常，证实EV71-link-EGFP重组病毒拯救成功。重组病毒滴度的曲线峰值与野生型病毒滴度的峰值相同。重组病毒中EGFP的表达在48h时最高。重组病

3、毒中GFP和P1蛋白表达正常稳定。经过13轮传代，第13代重组病毒表达的GFP蛋白与第1代无明显差别。结论通过添加link序列成功构建了非融合表达的EV71-link-EGFP重组病毒，可在RD细胞中良好生长并高效表达EGFP,且具有稳定的遗传性。关键词：人肠道病毒;肠道病毒71型;绿色荧光蛋白;荧光标记;基因重组;作者简介：耿磊(1974-)，男，硕士，副教授，主要研究方向为抗病毒药物筛选。E-mail:778175260@qq.com作者简介：王清路(1976-)，男，博士，教授，主要研究方向为中医药抗病毒研究。E-mail:wql_zcq@126.com收稿日期：2017-06-

4、02基金：山东省高校中医药抗病毒协同创新中心基金资助项冃(XTCX2014B01-07)ConstructionofEV71genomelabeledbynon-fusionenhancedgreenfluorescentproteinGENGLeiDOUYeWANGQingluQiluMedicalUniversity;Abstract：ObjectiveToconstruettheEnterovirus71(EV71)labeledbynon-fusionenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)soastoprovideamethodforstud

5、yingtheanti-viralmechanismofEV71andscreeningofantiviraldrugs.MethodsTheEV71genomelabeledbyEGFPwasconstructedbyconnectingnon-fusionlink-EGFPsequenceinthebackof3Dsequenceandfrontof3"-UTR,andthennewEV71viruswasobtainedbytransferringEV71-link-EGFPplasmidintoRDcellline.ThelocationoflinkandEGFPsequenc

6、ewereident/ifiedbyPCR.VirustiterwasestimatedwithTCTD5Omethodsatthe24,4&72,96,120,144,and168hafterRDcellswereinfected,respectively.ThemRNAlevelwasanalyzedbyRT-PCR.TherecombinantviruswasusedtoinfecttheRDcellsandRDcellslysedafter72h.TheGFPandPlproteinexpressionwasdetectedbyWesternblotting.Afterther

7、ecombinantvirusinfectedRDcells,andafter13roundsofpassage,theEGFPgenestabilitywasdeterminedbyWesternblotting.RcsuItsEV71-link-EGFPrecombinantviruswasobtainedviaanalyzingmRNAexpressionlevel,observingGFPfluorescenceandlocatingl