串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与

《串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与【摘要】　　目的：构建绿色荧光蛋白-串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体（HisEGFP3xNLS），并在原核细胞中进行表达与纯化。方法：采用PCR方法从原先克隆在pEGFPC1载体中的3xNLS与EGFP编码序列扩增出来，使用常规酶切和连接方法将其重组至pET14b载体中，对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株，用IPTG诱导融合蛋白表达，并利用NiNTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果：构建的HisEGFP

2、3xNLS融合蛋白表达载体是正确的，该载体可在大肠杆菌内高效表达，用NiNTA纯化获得了相对分子质量约36kD的融合蛋白。结论：成功构建了HisEGFP3xNLS融合蛋白表达载体，并在原核细胞中获得了高效表达和纯化，为进一步研究NLS介导信号分子入核提供了实验材料。【关键词】核定位信号载体蛋白质类基因表达蛋白纯化　　［Abstract］Objective:ToconstructtheexpressionvectorofHisEGFP3xNLSfusionproteinandobtainit

3、sexpressionandpurificationinE.coli.Methods：3xNLSandEGFPsequenceplifiedbyPCRfrompEGFPC13xNLSvectorandclonedintopET14bvectorfolloedigestion,PCRandsequencing,thepositiveclonesedintoBL21(DE3)petentcells,andtheexpressionofHisEGFP3xNLSfusionproteinatogr

4、aphy.Results:TheconstructedHisEGFP3xNLSfusionproteinvectorhighlyexpressedinE.coli.iniprepKit和NiNTA亲和树脂是QIAGEN公司产品，限制性内切酶(NdeI、BamHI)、T4DNA连接酶和Pyrobest高保真DNA聚合酶购自TaKaRa公司，100bp和1kbDNAladder分别是Toyobo公司和Stratagene公司产品，异丙基-β-D-硫代半乳糖（isopropylβDthioga

5、lactoside,IPTG）购自SigmaAldrich公司，引物由英骏公司合成。　　1.3HisEGFP3xNLS融合载体的构建　　见图1。从pEGFPC13xNLS载体中扩增EGFP和3xNLS所用的上游引物序列为5’tacatatgatggtgagcaagggcgaggagct3’，其中下划线部分是EGFP基因编码序列的第1～23位碱基；下游引物序列为5’taggatccttacgggcccgcggtaccgtcgactgca3’，其中下划线部分是添加的终止密码子及pEGFP

6、C1载体上BamHI位点前的25位碱基的反向互补序列。用Pyrobest高保真聚合酶进行PCR反应（95℃30s,55℃30s,72℃60s，共30个循环），扩增片段大小为848bp。将PCR产物用NdeI和BamHI酶切，随后与NdeI和BamHI双酶切并电泳切胶回收的pET14b连接，将连接反应混合物转化大肠杆菌株DH5α。挑取单菌落接种于Amp+的LB培养基中，37℃振摇过夜。取5ml菌液用QIAprepSpinMiniprepKit小量提取质粒后，用NdeI和BamHI酶切鉴定。另外使用

7、上述引物对重组体进行PCR鉴定。酶切及PCR鉴定产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶图像分析仪上成像。重组体最终经测序鉴定无误后，置-20℃保存备用。　　1.4HisEGFP3xNLS融合蛋白的原核表达及纯化　　　　将阳性重组质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)。挑取单菌落，置于2mlLB(Amp+)培养基中，37℃振摇培养至D600约为0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导，继续振摇3h。利用12%SDSPAGE来鉴定表达融合蛋白的菌落。对有HisEGFP3xNLS融合

8、蛋白表达的菌落进行大量（100ml）菌液扩增诱导，6000×g、4℃离心10min；将细菌沉淀重悬于4ml结合缓冲液（300mmol/LNaCl,50mmol/LNaH2PO4,10mmol/L咪唑,0.1%TritonX100,pH8.0）中，超声破碎，15000×g,4℃离心15min。将上清加入100μlNiNTA亲和树脂中4℃孵育1h，然后用1ml的洗涤缓冲液（300mmol/LNaCl,50mmol/LNaH2PO4,20mmol/L咪唑,pH8.0）洗