串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与原核表达

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1、串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与原核表达【摘要】　　目的：构建绿色荧光蛋白-串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体（HisEGFP3xNLS），并在原核细胞中进行表达与纯化。方法：采用PCR方法从原先克隆在pEGFPC1载体中的3xNLS与EGFP编码序列扩增出来，使用常规酶切和连接方法将其重组至pET14b载体中，对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株，用IPTG诱导融合蛋白表达，并利用NiNTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果：构建的HisEGFP3xNLS融合

2、蛋白表达载体是正确的，该载体可在大肠杆菌内高效表达，用NiNTA纯化获得了相对分子质量约36kD的融合蛋白。结论：成功构建了HisEGFP3xNLS融合蛋白表达载体，并在原核细胞中获得了高效表达和纯化，为进一步研究NLS介导信号分子入核提供了实验材料。【关键词】核定位信号载体蛋白质类基因表达蛋白纯化　　［Abstract］Objective:ToconstructtheexpressionvectorofHisEGFP3xNLSfusionproteinandobtainitsexpressionandpuri

3、ficationinE.coli.Methods：3xNLSandEGFPsequencewasamplifiedbyPCRfrompEGFPC13xNLSvectorandclonedintopET14bvectorfollowingtheroutineprocedures.Afteridentificationbyenzymedigestion,PCRandsequencing,10thepositiveclonesweretransformedintoBL21(DE3)competentcells,andth

4、eexpressionofHisEGFP3xNLSfusionproteinwasinducedwithIPTGandfurtherpurifiedbyNiNTAaffinitychromatography.Results:TheconstructedHisEGFP3xNLSfusionproteinvectorhighlyexpressedinE.coli.WithNiNTAaffinitychromatography,apurifiedHisfusionproteinwithrelativemolecul

5、armassofapproximately36kDwasobtained.Conclusion:TheexpressionvectorofHisEGFP3xNLSfusionproteinisconstructed,expressedandpurifiedundernondenaturingconditions,whichmaysignificantlyfacilitatefuturestudyofthemechanismbywhichNLSmediatethenucleartranslocationofcerta

6、insignalmolecules.　　［Keywords］nuclearlocalizationsignal;carrierproteins;geneexpression;proteinpurification　　信号转导的时空特征，即信号蛋白的亚细胞定位（subcellularlocalization）和激活后移位（translocation）已成为目前细胞信号转导研究的热点领域[1，2]，信号分子的特异性亚细胞定位有助于细胞高效经济地完成各种正常生理功能和病理反应。在刺激诱导的多种不同信号分子的移位入核过程中，核定

7、位信号（nuclearlocalizationsignal,10NLS）都扮演着重要的角色[2～4]，但目前NLS与核孔复合体（nuclearporecomplex,NPC）的相互作用介导信号分子入核的具体机制仍未完全阐明。本实验构建了与增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）融合的3个串联重复的NLS融合蛋白原核表达载体，为研究NLS介导信号分子入核的机制提供了一个重要的工具。　　1材料和方法　　1.1质粒　　带有三个串联重复的NLS（3xNLS）增强型绿色荧光蛋白

8、载体pEGFPC1由挪威TromsΦ大学Seternes教授馈赠，该质粒中3xNLS的序列为aggaagaggaagctgctgaggaagaggaagctgctgaggaagaggaagctgctg，利用HindIII和PstI克隆在pEGFPC1中。将质粒转化大肠杆菌株DH5α，提取质粒DNA，用DNA/RN