抗骨刺酊微生物限度检查方法验证

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1、抗骨刺酊微生物限度检查方法验证湖南中医药高等专科学校附属第一医院湖南省直中医医院湖南株洲412000ValidationmethodforthemicrobiallimitstestofKangguciDingLONGHuanzhouHUXuelai（TheFirstAffiliatedHospitalofHunanTraditionalChineseMedicalCollege（HunanProvincialHospitalOfTraditionalChineseMedicine）,Zhuzhou,Hunan412000）【摘要】目的：建立抗骨刺酊的

2、微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010版一部附录微牛物限度检查法验证的要求对抗骨刺酊微牛物限度检查进行了方法建立和验证研究。供试液制备采用稀释法，制成1：10供试液。采用培养基稀释法（1:10供试液，每皿lmL）进行细菌计数检验，稀释法（1:10供试液，每皿lmL）进行霉菌及酵母菌计数检验，采用常规法进行控制菌检查。结果：5种验证菌株的回收率均高于70%；控制菌检查经方法验证，可按常规法进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查。结论：建立的方法准确、可靠、重现性好，适用于抗骨刺酊的微牛物限度检查。【关键词】抗骨刺酊；微生物限度；方法验证抗骨刺酊

3、是由制川乌、制草乌、独活、五加皮、赤芍等25味中药组成的医院自制制剂。功能祛风除湿，活血通络止痛。主治退行性骨关节炎，骨质增牛性疼痛，风湿性关节疼痛。按《中国药典2010年版一部》⑴要求，需做细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌检查，同时需对检验方法进行验证，以确保检验方法的准确可靠。1试验材料1.1仪器净化工作台、手提式压力蒸汽消毒器、恒温水浴锅、TP-320A电子天平（感量0.01g）＞恒温培养箱、牛化培养箱、锥形瓶（100〜150mL）.平皿（90mm）、量筒（100mL）＞试管（18×180mm）及塞、吸管（ImL分度0.OlmL,10m

4、L）均于180°C干热灭菌2h或高压蒸汽121°C灭菌30min,烘干备用。1.2试验样品抗骨刺酊湖南中医药高等专科学校附属第一医院（批号：140315＞140611＞131121）1.3实验菌株金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102＞枯草芽孑包杆菌CMCC（B）63501、白色念珠菌CMCC（B）98001,黑曲霉CMCC（F）98003等，均购自中国医学细菌保藏中心。1.4培养基营养琼脂培养基（批号：140625）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号:141203）＞改良马丁培养基（批号:140527）、改良马丁琼脂培养基

5、（批号：140708）＞营养肉汤培养基（批号：140614）、胆盐乳糖培养基（批号：141115）、澳化十六烷基三甲鞍琼脂培养基（201405137）、卵黄氯化钠琼脂培养基（201405051）（均由北京路桥技术有限公司生产）1.5试剂及稀释剂pH7.0的无菌氯化钠■蛋白月东缓冲溶液（批号：140216,由北京路桥技术有限公司生产）、氧化酶试液（批号：140206）.冻干兔血浆（批号：140905）（由北京陆桥技术有限责任公司提供）、0.9%灭菌氯化钠溶液。2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证⑵[3]验证试验进行三次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次

6、试验的冋收率。2.1方法2.1.1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽泡杆菌新鲜培养物至营养肉汤中，在30〜35°C培养18〜24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，在25°C培养24〜48小吋。上述培养物均用0.9%灭菌氯化钠溶液制成每ImL含菌数为50〜100CFU的菌悬液，备用。2.1.2供试液制备分别取供试品各10mL,加pH7.0的无菌氯化钠•蛋白腺缓冲溶液制成10的均匀供试液，备用。2.1.3试验组细菌计数采用常规法。取b10的供试液ImL,置平皿中，每个平皿加试验菌液ImL.加入营养琼脂培养基15〜20mL,平行

7、制备2个平皿，放冷，倒置平板，在30〜35°C温度培养48小时，观察结果。按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。霉菌和酵母菌计数采用常规法，取X10的供试液ImL.置平皿中，每个平皿加试验菌液ImL,加入玫瑰红钠琼脂培养基15〜20mL,平行制备2个平皿，放冷，倒置平板，在25°C温度培养72小吋，观察结果。按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。2.1.4菌液组分别取50〜100CFU/mL的试验菌液：LmL注入平皿中，立即倾注培养基，平行制备2个平皿，置适宜温度培养48〜72小吋，观察结果，按《中国约典

8、2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。2.1.5供试品对照组按《中国药典2010年