鸡白介素6的原核表达及单抗的研制

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1、鸡白介素6的原核表达及单抗的研制Prokaryoticexpressionofchickeninterleukin6anddevelopmentofmonoclonalantibodyagainstchickeninterleukin6[本文受公益性行业科研专项(201003012)和国家863计划(2011AAlOA209)资助]研究生：邹晓艳专业：预防兽医学导师：彭大新教授陈素娟副教授刘秀梵教授扬州大学兽医学院2012年5月邹晓艳：鸡白介素6的原核表达及单抗的研制鸡白介素6的原核表达及单抗的研制研究生：导师：邹晓艳彭大新教授陈素娟副教授刘秀梵教授摘要鸡白介素6(ChIL．6)既参与疾病发生

2、过程，又可作为免疫佐剂在免疫治疗方面起重要作用，是-t0多功能的细胞因子，是当前免疫学研究的热点。ChlL．6的检测通常使用免疫学、生物学活性测定和分子生物学等方法。生物学检测法较敏感，可以直接测定ChlL．6的生物学功能，但是该方法需要培养依赖ChlL．6生长的细胞株，检测耗时长、步骤复杂。ELISA方法可用于检测ChIL．6，但是需要有针对ChIL．6不同抗原表位的抗体。因此，建立一种具有自主产权的方便、快速、实用的检测ChIL．6的方法是目前我们急需解决的问题之一。本研究利用原核表达ChIL一6，获得了可溶性的ChlL．6，研制并获得了针对ChIL一6的单克隆抗体，为建立ChIL一6的快

3、速检测方法奠定基础。通过PCR扩增570bp鸡IL一6成熟肽基因，克隆至原核表达载体pEY-32a(+)，构建pET-ChlL一6重组质粒，转化大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达。SDS．PAGE结果显示，重组鸡白细胞介素一6(rChIL一6)蛋白大小为40kDa左右；可溶性分析表明，rChlL一6蛋白大部分存在于裂解液上清中；生物学活性测定显示，10ng／mLrChIL一6即能有效地促进IL．6依赖性细胞系7TDl细胞的增殖能力；用pcDNA．IL．6质粒免疫小鼠所得的血清为一抗进行Westernblot，结果证明rChIL一6具有良好的抗原特异性。先以pcDNA．IL．6重组质粒为免疫原

4、肌肉注射免疫8周龄的Balb／c雌鼠，100gg／只，每2周免疫1次，4免后用rChIL．6蛋白加强免疫一次，取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0融合。以rChIL．6纯化蛋白作为筛选的抗原，HIS蛋白为阴性对照，用ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选，选择ChIL．6反应呈阳性、HIS蛋白反应呈阴性的孔进行亚克隆，共获得3株针对鸡IL一6的特异性单克隆抗体，分别为188、4G8和6C12，腹水的间接ELISA效价分别扬州人学硕十论文为：1：64000、1：256000和1：256000；亚类鉴定结果显示，4G8为lgG亚类，188和6C12单抗均为IgM亚类；3株单克隆抗体均能与pcDNA—IL。6

5、转染的COS一1细胞反应产生特异性绿色荧光。Westernblot结果显示3株单克隆抗体均与rChlL．6和rChlL6。1蛋白反应，不与rChlL6．2和HIS蛋白反应。6C12单克隆抗体具有中和rChlL．6的促进7TDl细胞增殖的能力。本研究成功构建了ChIL一6成熟肽基因的原核表达质粒，并且获得了具有活性的rChlL一6蛋白，研制出3株针对ChlL一6单克隆抗体，其中1株单克隆抗体具有中和活性。ChlL一6单克隆抗体的制备为建立天然ChIL．6的检测方法和研制ChlL．6治疗剂奠定基础。关键词：鸡IL一6；原核表达；单克隆抗体；中和活性邹晓艳鸡白介素6的原核表达及单抗的研制Prokar

6、yoticexpressionofchickeninterleukin6anddevelopmentofmonoclonalantibodyagainstchickeninterleukin6M．S．candidate．XiaoyanZouAdvisor．Prof．DaxinPengAssociateProf．SujuanChenProf．XiufanLiuAbstractChickeninterleukin6(ChIL-6)involvesinthediseaseprocess，andplaysanimportantroleasanadjuvantinimmunotherapy．Itisam

7、ultifunctionalcytokine，whichisacurrentresearchfocusofimmunology．Immunoassay,bioassayandmolecularbioassayareusedtodetectChIL一6BioassayisasensitivemethodandcanbeusedtoevaluatedthebioactivityofChIL一6prot