红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定.pdf

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1、第30卷第6期2015年12月大连海洋大学学报JOURNALOFDALIANOCEANUNIVERSITYVol_30No．6Dec．2015DOI：10．16535／j．cnki．dlhy】(b．2015．06．005文章编号：2095—1388(2015)06一0598—06红鳍东方纯白介素15的原核表达及其活性测定孙赛红1，马普1，李慧1，孙鹤1，孔德荣1，李风华2，仇雪梅1，姜志强1，刘海映3，刘圣聪4，王秀利1(1．大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023；2．大连三仪动物药品有限公司，辽宁大连116036；3．大连海洋大学海

2、洋科技与环境学院，辽宁大连116023；4．大连天正实业有限公司，辽宁大连116011)摘要：为了开发红鳍东方鲍死七∥谵u九庙riPes免疫基因及其重组表达，生产重组免疫因子蛋白，通过提取红鳍东方纯肾脏组织总RNA，利用RT—PCR技术扩增得到白介素15(intedeukinl5，ILl5)基因序列，将ILl5成熟肽序列与原核表达载体pET一32a(+)连接，成功构建重组表达载体(重组子)pET一32a(+)一见15，并将其重组子转化至西ck矗oco如BL2l(DE3)感受态细胞中获得重组表达儿15的基因工程菌，再经I胛G诱导，pET一32a(

3、+)一儿15在BL21中得到了融合表达。结果表明：通过对表达产物的纯化和westemBlotting检测，红鳍东方纯ILl5在大肠杆菌中的表达量较高，蛋白浓度为294．6斗g／mL；用M盯法对该蛋白进行活性鉴定显示，加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲍ILl5蛋白时，cTLL一2细胞的增殖率相对较高，分别为71％和73％。研究表明，重组红鳍东方纯ILl5蛋白具有体外促进cTLL一2细胞增值的能力。关键词：红鳍东方纯；白介素一15；原核表达；活性鉴定中图分类号：S965．225文献标志码：A红鳍东方纯黜咖弘m6却船是一种重要的海水养殖鱼类。近

4、年来，由于海水养殖环境的恶化及该品种个体抗病力的弱化，红鳍东方纯病害时有发生，给养殖生产和出口创汇造成了严重的经济损失⋯。随着红鳍东方纯高密度、工厂化、集约化养殖模式的建立和推广，养殖面积不断扩大，病害问题也随之逐年严重。抗生素和化学药物的过度使用，不仅造成水环境的污染，而且导致部分病原微生物耐药性增加并在水产动物体内残留，严重影响了水产品安全，给产业发展和人类健康也带来了威胁。因此，开发红鳍东方纯免疫因子基因及其重组表达，生产重组免疫因子蛋白，代替抗生素和化学药物，并广泛应用于红鳍东方纯健康养殖中，具有重要的科学意义和实际应用价值。在鱼类的先

5、天性免疫机制中，干扰素、白介素(interleukin)、补体、抗菌肽、Mx蛋白、溶菌酶等免疫因子具有特别重要的生理功能旧。51。白介素主要作用于巨噬细胞和淋巴细胞，在信号传递和调节细胞活化、增殖和分化等方面起重要作用∞J。白介素15(intedeukin15，ILl5)是一种重要的细胞因子，存在于多种细胞和组织中，具有促进淋巴细胞活性和NK细胞增殖并增强其生物活性的作用。此外，ILl5能刺激T细胞增殖、诱导B细胞增殖、刺激免疫球蛋白分泌、诱导特性抗原产生、激活信号转导和转录激活蛋白等多种功能o7

6、。Bei等哺1克隆了红鳍东方纯的见15基因，基

7、因全长817bp，其中编码序列504bp，编码167个氨基酸；红鳍东方鲍儿15包含4个保守的半胱氨酸，使2个二硫桥和4个仅螺旋得以形成；红鳍东方纯尼15基因在外周血细胞、胸腺、头肾、肾、脾、心脏、性腺、肠、皮肤、鳃、脑、肌肉和肝脏等组织中均有表达，表明见15在红鳍东方纯的组织表达与在哺乳动物中有同样的表达模式。目前，重组人白介素、重组家畜和家禽等白介素产品已得到广泛的应用并取得了巨大的经济效益和社会效益，但在鱼类中开展重组白介素应用研究的报道不多。而有关红鳍东方纯白介素15的研究仅见Bei等旧1对红鳍东方纯儿15基因的克隆及其诱导表达。为此，本

8、研究中克隆了红鳍东方纯白介素15成熟肽基因序列，并将其重组在原核表达载收稿日期：2015—09—19基金项目：国家海洋公益性行业科研专项(201405003—2)；大连市科技计划项目(2叭4811Nc091)作者简介：孙赛红(1988一)，女，硕士研究生。E—mail：sun．saihong@163．com通信作者：王秀利(1964一)，男，博士，教授。E—mail：】clw∞g@dlou．edu．cn第6期孙赛红，等：红鳍东方鲍白介素15的原核表达及其活性测定599体上，构建基因工程菌，再经诱导表达和分离纯化，对重组红鳍东方纯ILl5蛋白进行

9、生物活性测定，旨在为开辟防治红鳍东方纯相关疾病的新方法提供参考。1材料与方法1．1材料试验用健康红鳍东方纯采自大连天正实业有限公司，日龄为266d。1