红鳍东方鲀PPARγ真核基因表达载体构建及亚细胞定位研究-论文.pdf

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1、现代农业科技2014年第l8期动物科学红鳍东方纯PPAR~,真核基因表达载体构建及亚细胞定位研究张伟1,2付云李翠萍渡部终五(新乡医学院基础医学院，河南新乡453003；东京大学农学部水产化学研究窒)摘要f目的1旨在克隆红鳍东方鲍Ry基因的cDNA，并通过构建真核表达载体pCMV一3Tag一4A—PPAR，分析myc—PPAR~融合蛋白在大鼠L6细胞的表达及亚细胞定位。『方法1利用RT—PCR技术克隆红鳍东方鲍P基因的cDNA，构建pCMV一3Tag一4A—PPAR~重组质粒，转染至大鼠L6细胞，共聚焦显微镜下观察myc—PPAR~的亚细胞定

2、位。[结果】红鳍东方鲍附R．y基因cDNAORF全长1557bp，共编码518个氨基酸，pCMV一3Tag一4A—PPAR．y融合蛋白在大鼠I细胞核中表达，为深入探讨鱼类Ry生物学功能奠定了基础。关键词红鳍东方纯；4Ry基因；亚细胞定位中图分类号$917．4文献标识码A文章编号10o7—5739(2014)18—0243—02ConstructionofEukaryoticExpressionVectorandSubeellularLocalizationofPPARTintorafuguTakifugurubripesZHANGWei·0F

3、UYunLICui—pingDUBnZhongWu(SchoolofBasicMedicalScience，XinxiangMediealUniversity，XinxiangHenan453003；DepartmentofAquaticBioscience，GraduateSchoolofAculturalandLifeSciences，TheUniversityofTokyo)Abstract『0bjective]TheaimofthestudyWastoclonecDNAof只RyinTokif~rubripes，andanalyzed

4、subcellularlOCalizationoftheexpressionproductthroughmycfusionprotein．[Method】TheeDNAofTak／fugurubripesRgenewasclonedbyRT—PCRandtherecombinanteukaryoticexpressionvectorspCMV一3Tag—4A—PPAR~wereconstructedandusedforratL6cellstransfection．[Result]TheeDNAORFofPR’，hadalengthofl557

5、bpencoding518aminoacids．ThepolyclonalantibodyagainstPPAR~hadbeenpreparedsuccessfully；theconjugatedpmteinwasemcientlyexpressedinthee~oplasmofratL6cells．TheseresultshadagoodvalueforfurtherresearchofPjRyfunction．Keywordsrubripes；4Rygene；subcellularlocalization鱼类脂肪沉积呈高度物种特异性，例如

6、河豚鱼、比目鱼行保存。的脂肪主要沉积在肝脏，其他物种如真鲷和鳗鱼的脂肪主要1．2主要试剂沉积在肝脏和骨骼肌【l】。不同的脂肪沉积部位可能是由组织SuperScriptmreversetranscriptase、lipofectamine2000均特异性的脂肪代谢通路引起的121。脂肪代谢通路在分子水平购自Invitrogen公司；pGEMT—easy载体、T4DNAligase购自主要是由一些重要的转录因子和酶进行调控，因此关于转Promega公司：BamHI和XhoI限制性内切酶、LATaqDNA录因子对鱼类脂肪代谢的调控机制是目前水产学研

7、究的热聚合酶、TaqDNA聚合酶、AgroseGelDNApurification试剂点。过氧化物酶体激活增殖物受体(Peroxisomeproliferator—盒均购自Takara公司：质粒小提试剂盒购(Sigma—Aldrich)；activatedreceptors，PPARs)是一类重要的核转录因子，分为小鼠抗anti—myc单克隆抗体购自Sigma；alexafluor488ami—3种亚型，分别是PPARot、PPAR和PPARD／8[31。PPAR~／是mouseIgG(H+L)二抗购自Molecularprobes；其他试剂

8、均为动物体内脂肪代谢的生理传感器，在脂肪细胞分化中起到分析纯。重要的作用，其主要生理学功能表现为促进脂肪细胞进行1．3PPAR~,ORF的扩增及克隆早期分化和正向调