红鳍东方鲀ifnγ基因和ccl19基因的原核表达及重组il15的活性鉴定

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1、分类号密级UDC编号硕士学位论文红鳍东方鲀IFNγ基因和CCL19基因的原核表达及重组IL15的活性鉴定马普（1216005）指导教师姓名王秀利教授专业名称生物化学与分子生物学论文答辩日期2015年6月1日学位授予日期2015年7月ThesisForTheDegreeOfMasterProkaryoticexpressionofIFNγgeneandCCL19geneandtheactivityidentificationofrecombinatonIL15ofTakifugurubripesSupervisor：Prof.WangXiuliM

2、asterCandidate：MaPuCollegeoflifescienceandbiotechnologyDalianOceanUniversity(BiochemistryandMolecularBiology)Dalian,LiaoningProvince,P.R.ChinaJune2015摘要摘要红鳍东方鲀（Takifugurubripes）是一种重要的经济鱼类，然而，水环境中存在的大量细菌和病毒使鱼类的皮肤和黏膜不断受到侵袭，这些病原微生物侵入鱼体后会使鱼体发生病变甚至死亡，给红鳍东方鲀的大规模养殖造成严重损失。细胞因子能够调节免疫

3、应答，是一类具有生物学活性的小分子蛋白。干扰素具有抗病毒、调节细胞生长及分化等功能，趋化因子对白细胞具有趋化作用，在炎症反应中发挥着重要作用。本实验提取了红鳍东方鲀头肾组织的总RNA，并以其为模板进行RT-PCR扩增干扰素γ（IFNγ）和趋化因19(CCL19)成熟肽的基因序列。将扩增得到的基因片段与克隆载体pMD19-T相连，测序结果表明成功克隆到了红鳍东方鲀IFNγ和CCL19的基因序列。对IFNγ和CCL19的氨基酸序列进行生物信息学分析，结果表明，IFNγ蛋白具有22个氨基酸组成的信号肽，与绿河鲀IFNγ相似性为62%，亲缘关系最近。红

4、鳍东方鲀CCL19蛋白具有26个氨基酸组成的信号肽，与大黄鱼CCL19相似性为63%，亲缘关系最近。对IFNγ和CCL19基因进行NcoⅠ/XhoⅠ双酶切后与表达载体PET-32a(+)相连，成功构建了表达载体PET-32a(+)-IFNγ和PET-32a(+)-CCL19。将其转化入E.coliBL21（DE3）感受态细胞后用IPTG成功诱导表达出大小为37.835KDa和28.375KDa的目的融合蛋白。探索两种目的蛋白的最佳表达条件发现，IFNγ在IPTG浓度为1mmol/L，37℃诱导6h时目的蛋白表达量最大，CCL19在IPTG浓度为

5、0.5mmol/L，37℃诱导4h时目的蛋白表达量最大。用Ni-NTA柱纯化融合表达的目的蛋白，并用SDS-PAGE凝胶电泳和WesternBlotting检测表明纯化获得了较高纯度的红鳍东方鲀IFNγ和CCL19融合蛋白。利用本实验室已构建好的红鳍东方鲀IL15原核表达载体诱导表达并纯化得到IL15融合蛋白，蛋白浓度为294.6μg/ml。用MTT法对该蛋白进行活性鉴定表明，加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时CTLL-2细胞的增值率最高，分别为71%和73%，表明重组红鳍东方鲀IL15具有明显的体外促进CTLL-2细胞增值

6、的能力。关键词：红鳍东方鲀；IFNγ；CCL19；IL15；原核表达；活性鉴定IAbstractAbstractTakifugurubripesisanimportantcommercialfish.However,bacteriaandvirusesinthewaterenvironmentmakefishskinandmucousmembraneattacked.Lesionsanddeathwillhappeninfishbody,causingseriousdamagetothelarge-scaleaquacultureofT.rub

7、ripes.Cytokineisaclassofbiologicallyactivesmallmoleculeprotein,whichcanmodulatetheimmuneresponse.Interferonhasanti-viral,regulationofcellgrowthanddifferentiation,andotherfunctions.Chemokinehaschemotacticeffectonleukocyte,playinganimportantroleintheinflammatoryresponse.Inthis

8、study,totalRNAwasextractedfromT.rubripesheadkidneytissue,andasatemplatetoam