高表达p2x7受体抑制宫颈癌caski细胞生长的实验研究

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1、分类号R392密级公开UDC硕士学位论文高表达P2X7受体抑制宫颈癌Caski细胞生长的实验研究学位申请人：孙丽学科专业：免疫学指导教师：韩莉教授刘朝奇教授二○一二年五月三峡大学硕士学位论文ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineThestudyofhighexpressionofP2X7receptorinhbitsthegrowthofCaskicervicalcancercellsGraduateStudent:SunLiMajor:Im

2、munologySupervisor:Prof.HanLiProf.LiuChaoqiChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2012三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作

3、为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：I三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：检测宫颈癌Caski细胞表面是否表达有功能的P2X7受体；探讨在Caski细胞上稳定高表达P2X7受体后对细胞生长的影

4、响；进一步探讨外源性三磷酸腺苷（ATP）对高表达P2X7受体的Caski细胞的生长影响。方法：(1)应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术(FCM)、免疫组化技术检测宫颈癌上P2X7受体的表达。(2)将质粒pcDNA6/V5-His-P2X7转染至Caski细胞，用RT-PCR、Westernblotting、细胞免疫荧光等方法检测P2X7受体在真核细胞内的表达及定位，为检测高表达P2X7受体对细胞生长的影响用MTT法检测细胞增殖。(3)进一步检测P2X7受体的天然配体ATP处理后对高表达细胞生长的影响，用MTT检测细胞生存率，荧光染色法检测线粒体膜电位的变化，FCM

5、检测细胞凋亡率以及Westernblotting分析凋亡相关蛋白的变化。结果：(1)RT-PCR、FCM、免疫组化结果表明在宫颈癌Caski细胞上P2X7受体的表达减少。(2)稳定细胞株的建立：通过抗性筛选获得稳定表达P2X7的Caski细胞株(Caski/P2X7)和阴性对照细胞株(Caski/3.1)。RT-PCR结果显示转染质粒pcDNA6/V5-His-P2X7的Caski细胞出现约180bp条带，阴性对照细胞株(Caski/3.1)无条带出现；Westernblotting检测转染质粒pcDNA6/V5-His-P2X7的Caski细胞出现约75KDa的目的条带；荧光显

6、微镜下观察结果显示在Caski细胞膜上有红色荧光，表明有P2X7的蛋白表达，而阴性对照细胞未见荧光。MTT分析高表达P2X7受体后可抑制Caski细胞增殖。(3)用ATP处理Caski/P2X7和Caski/3.1细胞后，与对照细胞Caski/3.1比较，ATP处理后抑制Caski/P2X7细胞增殖较明显(*,p<0.05)；随着ATP浓度的增加FCM结果显示Caski/P2X7细胞凋亡率逐渐增加及线粒体膜电位逐渐降低；Westernblotting检测结果显示Caski/P2X7细胞胞质细胞色素C的含量增多另外抗凋亡蛋白Bcl2减少促凋亡蛋白Bax增加。结论：成功获得稳定高表达

7、P2X7受体的宫颈癌Caski细胞株，并且用ATP作用细胞后可抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡，本研究结果提示P2X7可作为肿瘤治疗和预防的潜在靶点。关键词：P2X7受体宫颈癌Caski细胞凋亡ATPII三峡大学硕士学位论文AbstractObjectiveTotesttheexpressionofP2X7receptorincervicalcancer,highexpressionofP2X7receptoroncellgrowthandfurtheranalyzetheeffec