逆转录环介导等温扩增技术对新城疫病毒的快速检测

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1、逆转录环介导等温扩增技术对新城疫病毒的快速检测计：学位论文：40页表格：1个插图：14幅杜景娇指导教师：滕文锋副教授申请学位级别：硕士学位专业名称：临床检验诊断学论文提交日期：2012年4月论文答辩日期：2012年5月学位授予单位：大连医科大学学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：独创性声明lliill／I／／／I／／l一／lIll一／／I／l，l／／／／／lvl／／／／l，lll／／-／／llll本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，

2、也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：丝年土月韭日关于学位论文使用授权的说明《逆转录环介导等温扩增技术对新城疫病毒的快速检测》系本人在大连医科大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本人及指导教师完全了解大连医科大学关于保存、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅，同意学校将本论文加入：1．中国学术期刊(光盘版)电子杂志社一一《中国博士学位论文全文数据库》、《中国优秀硕士

3、学位论文全文数据库》及CNK]相关数据库。2．中国科学技术信息研究所一一《中国学位论文全文数据库》3．国家图书馆本人授权大连医科大学，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文，可以公布论文的全部或部分内容。论文作者签名：指导教师签名：签字日期：日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5，、—1L—j一(一)刚舌”一””“”一一⋯””⋯”””“”⋯·····

4、·····················⋯····5(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．15(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯_⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26三、文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29(二)参考文献⋯000DOD⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36四、附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39五、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．40逆转录环介导等温扩增技术对新城疫病毒的快速检测硕士生姓名：杜景娇指导教师：滕文锋副教授专业名称：临床检验诊断学摘要新城疫是一种重要禽类传染病，危害严重，防控艰难。本研究利用逆转录环介导等温扩增技术(RT．LAMP)和LAMP实时检测技术建立了新城疫病毒检测方法，可以实现定性与定量测定。该方法有望替代现有的新城疫病毒核酸检测方法，实现新城疫快速确诊。该技术可以为新城疫的有效防控提供技术支撑。本研究可分为三个部分：第一部分：新城疫病毒融合蛋白基因(F基因)的克隆与序列分析参照GenBank中新城

6、疫病毒毒株融合蛋白基因，设计合成l对特异性引物，RT．PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM．T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选后得到重组质粒pGEM．T-NDV。重组质粒经PCR及测序鉴定，结果证实获得了新城疫病毒F基因。第二部分：新城疫病毒RT．LAMP检测方法的建立根据新城疫病毒F基因设计合成6条特异性引物，在恒温水浴中进行核酸扩增反应，对反应温度、反应时间以及反应液中[U92q浓度进行优化获得最佳反应条件，结果经凝胶电泳分析并在可见光下用肉眼直接观察。在凝胶电泳分析中，扩增产物呈多条带特征性分布，肉眼观察，可见反应产物发生浑浊。整个反应过程用时O．5h，检测

7、敏感度比RT．PCR高100倍，对其它非新城疫病毒RNA无检出。本研究建立的新城疫病毒RT．LAMP检测方法速度快、不需要高精密仪器，而且具有灵敏度高、特异性强，操作简单等特点。第三部分：新城疫病毒LAMP实时浊度定量分析在RT．LAMP检测新城疫病毒方法的基础上，建立了实时浊度检测系统对新城疫病毒的定量分析检测方法。整个检测O．5h内即可完成。原始质粒DNA模板的拷贝数在1．98x108到1．98x104范围内与浊度达到O．1的时间有着良好的线性关系，病毒的含量可以依据它达NISEI性值的时间通过标准