逆转录环介导等温扩增技术检测菜豆荚斑驳病毒-论文.pdf

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1、第40卷第5期植物保护学报Vo1．40No．52013年10月ACTAPHYT0PHYLACICASINICA0ct．2013逆转录环介导等温扩增技术检测菜豆荚斑驳病毒DetectionofBeanpodmottlevirususingthereversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationmethod郭立新段维军徐亚飞刘永丰张吉红(1．北仑出入境检验检疫局，宁波315800；2．宁波出入境检验检疫局，宁波315012)GuoLixinDuanWeijunXuYaf

2、eiLiuYongfengZhangJihong2(1．BeilunEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Ningbo315800，Zh~iangProvince，China；2．NingboEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Ningbo315012，ZhejiangProvince，China)菜豆荚斑驳病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)毒(Arabismosaicvirus，ArMV)阳性样品均购自美国可危害大豆、菜

3、豆等豆科植物，造成品质和产量下Agdia公司。RNeasyPlantMiniKit试剂盒购自Qia—降⋯。目前，检测BPMV主要采用DAS．ELISA技术gen公司；TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)试及基于RT—PCR的分子生物学方法⋯。近年来开发剂盒购自大连宝生物公司；FluorescentDetectionRe的环介导等温扩增(1oop—mediatedisothermalamplifi—agent、RNAAmplificationKit试剂盒购自日本荣研公cation，LAMP)是～种新的核酸扩增技

4、术，该技术依司。RT—LAMP引物及RT—PCR引物由英潍捷基赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和1个(上海)贸易有限公司合成。LA一320C实时浊度仪具有链置换特性的DNA聚合酶(BstDNApolymer-购自日本荣研公司。ase)，在等温条件下高效扩增靶基因，灵敏度和特异1．2方法性较高J。闻伟刚等_3将该技术运用到BPMV的总RNA的提取：按照RNeasyPlantMiniKit试检测中，但其依赖反应后开盖电泳观察判断结果，易剂盒说明书对样品及健康大豆叶片进行总RNA提造成气溶胶污染实验室。为此，本研究开展了菜豆取

5、。用核酸蛋白分析仪测定OD：。及OD。，计算核荚斑驳病毒的逆转录环介导等温扩增(RT—LAMP)酸的浓度和纯度。闭管检测，以期为BPMV的快速检测提供依据。RT—LAMP引物的设计和合成：从GenBank调出1材料与方法所有菜豆荚斑驳病毒大外壳蛋白基因序列，利用1．1材料DNAMAN6．0．40软件进行比对分析，找出BPMV菜豆荚斑驳病毒阳性样品购自美国Agdia公大外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设司，样品状态为新鲜叶片经液氮处理，磨成粉末状，计软件PrimerExplorerV4(http：／primerexpl

6、orer．jp／简写为BP—A。美国进口的两批大豆种子由宁波出elamp4．0．0／index．htm1)设计特异性引物。外侧上入境检验检疫局植物检疫实验室提供，经普通RT—游引物BP5．F3：5．CACCATCTGCTCTCAAGA一3；外PCR与DAS．ELISA检测确证含有BPMV，分别简称倾0下游弓I物BP5-B3：5-TCCTGAGAGGAAATAAAC-为YP一1和YP-2。感染南方菜豆花叶病毒(SouthernCAAT-3；内侧上游引物BP5．FIP：5-ACACGGGTIT—beanmosaicvirus，SB

7、MV)的大豆叶片总RNA由中GGATrAAATGACATCTGTGAA1fI’ATGGAATCCTGCT．国检验检疫科学研究院植物检疫研究所提供；番茄3；内1贝0—F游弓I物BP5-BIP：5-GGAATITCTGAAGc—环斑病毒(Tomatoringspotvirus，ToRSV)、烟草环斑GTACTGGATCCTGAACATCCTGCATTGG-3。病毒(Tobaccoringspotvirus，TRSV)和南芥菜花叶病RT．LAMP引物特异性检测：以BP—A及感染基金项目：宁波检验检疫局科研项目(甬K07—2011)，

8、国家质检总局科研项目(2011IK169，2012IK297)，宁波市社会发展科研项目(2012C50041)，国家科技支撑计划(2012BAK11B02)，宁波市科研项目(201IC50080)作者简介：郭立新，女，1976年生，高级工程师，研究方向为植物检疫，E—mail