苹果周期蛋白依赖性蛋白激酶基因mdcdkb1的克隆及表达分析

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1、山东农业大学硕士学位论文苹果周期蛋白依赖性蛋白激酶基因MdCDKB1的克隆及表达分析姓名：崔美申请学位级别：硕士专业：果树学指导教师：陈晓流；陈学森20120608山东农业大学硕士学位论文中文摘要果实的重量和大小是农业上很重要的两种性状，这种表型是由环境和基因共同作用的结果。苹果的果实大小与品种的基因型有关，主要由果实细胞数目和大小决定。果实细胞数目是由苹果果实发育早期的细胞分裂控制，控制细胞周期的相关基因调控果实的细胞数目，从而会影响最终的果实大小。研究果实发育过程中细胞周期相关基因的表达，对于研究调控果实大小相关的基因及这些基因表达的影响因素，以

2、揭示果实大小的发育规律、影响因素及调控，具有重要的理论和实践价值。本实验以富士和国光两个苹果品种为试材，从盛花后的心皮中克隆CDKB基因，并分别研究了花后不同发育阶段的果实中和两个品种的愈伤组织中CDKB基因的表达，主要结果如下：根据GenBank上植物的细胞周期依赖性蛋白激酶基因(C驯妇)相关的序列，设计扩增引物，分别从国光和富士盛花期后的心皮中克隆得到了921bp的片段，分为两种序列，其ORF均为915bp，编码304个氨基酸。经序列Blast，这两种序列核苷序列和蛋白序列的最大一致性序列均为植物的CDKB基因；其最大一致性EST序列分别是嘎啦苹

3、果中的两个EST序列：CV085424(CDKBI；1)和EBl38473(伽J?2)；生物信息学预测表明，其蛋白属于植物CDKB家族的成员，其蛋白序列中有植物细胞周期依赖性蛋白激酶B1(CDKBl)的基序PPTALRE。因此，把这两个序列命名为MdCDKBl；1和MdCDKBl；2。MdCDKBl；1在富士苹果和国光苹果中的序列号分别为：JX041699和JX041701：MdCDKBI；2在富士苹果和国光苹果中的序列号分别为JX041700、JX041702。在富士和国光果实发育的不同阶段，两品种中朋钬脚J?J基因的表达趋势大体一致：富士和国光M

4、dCDKBl；1基因表达量的高峰期都出现在花后21d，至花后4周期间其表达量较高，之后表达量呈下降趋势；但在花后7d-35d期间，国光比富士高0．33到l倍，差异显著；而在花后56d．77d时富士的表达量要比国光高出0．6到2倍。富士和国光肱把D脚J『?2基因表达趋势大体一致：高峰期都出现在花后7d，但到花后35d之间表达量较高，之后呈下降趋势，在7d．35d时国光要比富士的高0．16至1Jl倍：富士在花后119d时表达量略有上升，出现小峰值，此时富士是国光的6倍，两者差异显著。以国光和富士苹果的幼嫩叶片为外植体，经培养获得了大量优质的愈伤组织，把这

5、些愈伤组织分别放在不同的培养条件下进行培养，研究MdCDKBl基因及其亚基基因MdCKSl基因的表达。结果表明：(1)在MS培养基中分别添力nNAA、6．BA及NAA+苹果周期蛋白依赖性蛋白激酶基因MdCDKBl的克隆与表达分析6-BA，与未添加激素的基本MS培养基(对照)相比，培养一周之后，愈伤组织中MdCDKBl；1、MdCDKBl；2和MdCKSl基因的表达发生明显的变化：MdCDKBl；1、M托D胎，i2和MdCKSl在基本MS培养基上的表达量最低，在添加激素的培养基上的表达量都显著升高，M托rD胎JiJ、MdCDKBl；2和MdCKSl的表

6、达量分别提高0．8．2．5倍、l-4倍和O．8．1倍。其中，以在MS+NAA+6．BA培养基上，三个基因的表达量都增加得最多；在MS+NAA培养基上M北-D胎J?J、M托!脒8J『j2的表达量H二MS+6．BA培养基的略高，而MdCKSl表达量则在MS+NAA和MS+6一BA培养基差异不明显。这表明，．生长素或细胞分裂素都提高了愈伤组织中朋敬脚J『jJ『、MdCDKBl；2和MdCKSl的表达量；并且当二种激素同时存在时，MdCDKBl；1、MdCDKBl；2和MdCKSl的表达量高于单独的一种激素存在。(2)在相同的培养基上，国光和富士愈伤组织朋放

7、脚J，iJ『的表达量差异不明显，而C引四Jj2的表达量则是国光显著高于富士。愈伤组织在低温(10℃)下培养28d，抑制了蚴把引凹Jj』基因的表达；7d．14d的低温培养之后再经过常温培养，可以恢复MdCDKBl；1基因的表达。低温培养14d时抑制M托-D船J『?2基因表达的效果不明显；低温培养7d．28d再经过常温处理可以诱导MdCDKBl；2基因的高表达。低温培养7d后降低了MdCKSl基因的表达，低温培养14d后，MdCKSl基因的表达回升到常温培养下的水平；低温培养7d-14d后再经常温处理可以提高MdCKSl基因的表达量。关键词：苹果；果实发

8、育；细胞周期；伽；基因表达Ⅱ山东农业大学硕士学位论文CloningandExpressingAnalysis