1,25-二羟维生素d3调节巨噬细胞活化状态以抑制肾小管上皮细胞间充质转分化

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1、东南大学硕士学位论文1，25--二羟维生素D3调节巨噬细胞活化状态以抑制肾小管上皮细胞间充质转分化姓名：金艳盛申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：张晓良2012-06摘要1，25．二羟维生素D3调节巨噬细胞活化状态以抑制肾小管上皮细胞间充质转分化目的：巨噬细胞浸润是糖尿病肾病发生发展的重要环节。巨噬细胞活化状态对糖尿病肾病的发展具有重要作用。巨噬细胞可以分化为经典活化巨噬细胞(M1)和非经典活化巨噬细胞(M2)两种活化表型。调节巨噬细胞活化状态是于预糖尿病肾病进展的潜在有效手段。糖尿病’肾病的另一重要病理特征是肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)。近期发现，1，25．

2、二羟维牛素D3对糖尿病肾病有显著肾保护作用。我们通过体外研究首次探讨高糖对巨噬细胞分化的调节作用，以及这种作用对肾小管上皮细胞间充质转分化的影响，并进一步探索1，25．二羟维生素D3对巨噬细胞活化状态调节作用机制以及对EMT的抑制作用。方法：第一部分：采用高糖(右旋葡萄糖)浓度依赖性(20mM，30mM，35mM)以及时间依赖性(Oh，6h，12h，24h，48h)刺激人巨噬细胞系(U937)。检测巨噬细胞活化表型标志物：酶活性法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)(M1标志物)表达。RT-PCR法检测iNOSmRNA以及甘露糖受体(MRC，M2标志物)mRNA表达；ELI

3、SA法检测上清液中炎性细胞因子TNF．a、IL．12、IL一6(M1标志物)。第二部分：高糖(30mM，12h)刺激U937，分离上述细胞后与人肾小管上皮细胞(HK．2)共培养24h。观察HK．2细胞形态学改变，运用RT-PCR及Westernblot方法检测Fibronectin、a．SMA、E．Cadh．erin(EMT标志物)表达。第三部分：1，25．二羟维生素D3(10nM)干预高糖(30mM，12h)预孵育U937。检测巨噬细胞活化表型标志物：免疫荧光法检测U937内Fibronectin(M2标志物)；RT-PCR检测iNOS和甘露糖受体(MRC)mRNA，E

4、LISA法检测TNF．a、IL．12、IL．6。第四部分：1，25．二羟维牛素D3刺激高糖预孵育的小鼠巨噬细胞系(RAW264．7)。I东南大学硕士学位论文RT-PCR法检测iNOS(M1标志物)、MRC、IL．10、姆nasemRNA(M2标志物)；RT-PCR法检测VDR、PPAR丫mRNA。第五部分：1，25．二羟维生素D3干预高糖(30raM，12h)预孵育U937后，与HK-2共培养24h。观察HK-2细胞形态学改变，运用RT-PCR及Westernblot法检测Fibronectin、a．SMA、E．Cadherin。结果：第一部分：高糖浓度依赖性刺激U937

5、，各组中U937表达iNOS活性均增强(P<0．05)，iNOS活性呈浓度依赖性上升。其中，30mM高糖组刺激U937表达iNOS活性达最大值(48±6．6U／mgprot，P<0．01)。高糖时间依赖性刺激U937，高糖组从0至12h产生iNOS活性随时间延长表达逐渐增加，呈时间依赖性(P<0．05)。高糖刺激U937达12h时iNOS活性达最大值(2．2±0．13倍VS对照组，44．6±10．7U／mgprot)。在12h后，高糖组产生iNOS活性急剧下降，高糖组在24h至48h间产生的iNOS活性与对照组相比无明显差异(P>O．05)。iNOS活性在高糖组与IFNv

6、／LPS组(M1模型组)中，各个时间点间变化(0h至48h)均无明显差异(P>O．05)。高糖(30mM，12h)刺激iNOSmRNA表达增加(5．10E．05±1E．05，P<0．05)；MRCmRNA表达下降(P<0．05)。高糖(30mM，12h)刺激U937分泌IL-6、TNF-a、IL-12显著增加(645___57pg／ml，P<0．05；495±25pg／ml，P

7、、肥大，由椭圆形贴壁生长变为长梭形，丧失鹅卵石样特征性形态。HK．2细胞表达Fibronectin、a．SMA蛋白水平增加(0．86±0．05，P<0．05；0．76_+0．04，P<0．05)，同时Fibronectin及a．SMAmRNA表达亦显著增加(3．3E．02±3．5E．03，P<0．05；2．6E．05±2．1E．06，P<0．05)，E．Cadherin蛋白及mRNA表达降低(0．71±0．01，P<0．05；2．95E．04±1．14E．05，P<0．05)。第三部分：1，25一二羟维生素D3(10nM)刺激