smad7而非smad6基因可抑制tgfβ诱导肾小管上皮间充质转分化

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1、Smad7而非Smad6基因可抑制TGFβ诱导肾小管上皮间充质转分化：黄云剑,王梓华,张静波,梁莉,陈枫,赵景宏【摘要】目的:观察Smad6和Smad7基因能否抑制TGFβ诱导肾小管上皮间充质转分化。方法:构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体,再将病毒颗粒分别转染入人肾小管上皮细胞（HKC）,细胞随机分为正常对照、TGFβ1组、Smad7组、LacZ组、TGFβ1+Smad7或Smad6组、TGFβ1＋LacZ组。10μg/LTGFβ1添加入培养液孵育15、30、60、120min和3d。A）表达的影响,ELISA法测定培养上清羟脯氨酸的含量的变化,

2、倒置显微镜观察细胞形态变化。结果:与未加TGFβ1细胞相比,添加TGFβ1后15、30、60、120min胞内Smad2磷酸化水平明显增加,30min时表现最大。10μg/LTGFβ1与HKC孵育72h后,细胞αSMA和羟脯氨酸量合成增加,Ecadherin表达减少;细胞形态变长,呈纺锤状细胞,失去鹅卵石样的形状。Smad7基因转染可抑制TGFβ1诱导Smad2磷酸化,抑制细胞αSMA和羟脯氨酸合成,增加Ecadherin表达,维持培养细胞的上皮样形态,相反,Smad6没有这样的作用。结论:Smad7而不是Smad6基因转染能抑制TGFβ1诱导肾小管上皮间充质转分化,这

3、些作用可能与Smad7阻断Smad2磷酸化有关。【关键词】Smad7;Smad6;上皮间充质转分化;TGFβ;基因治疗肾小管上皮间充质转分化（epithelialmesenchymaltransition,EMT）是肾小管间质纤维化(Tubulointerstitialfibrosis,TIF)发生的重要原因之一,超过1/3的间质成纤维细胞于EMT,因此,寻找减缓EMT的方法是TIF研究的重点［1,2］。TGFβ是EMT的重要诱导剂之一,减少其对小管上皮的影响可能对TIF治疗有帮助。Smad6和Smad7蛋白是TGFβ家族细胞内信号转导的负调控蛋白（InhibitorySma

4、ds,ISmad）［3］。ISmads能与活化的TGFβⅠ型受体牢固结合,阻止Smad2和Smad3磷酸化,未磷酸化的Smad2和Smad3不能形成转录复合物进入核内,从而阻断了TGFβ对靶基因的转录。我们以往的研究发现Smad6和Smad7表达下调可能是TGFβ高表达致TIF的主要原因,但提高它们的表达能否抑制TGFβ诱导的EMT尚不清楚［4］。为此,我们采用腺相关病毒将Smad6和Smad7基因分别转染入人肾小管细胞中,观察其能否抑制TGFβ诱导的EMT,并分析其细胞内信号转导机制。1材料和方法1.1材料限制性核酸内切酶BamHI、XhoI及T4连接酶,均购自TaKaRa

5、公司。iniprepsDNAPurificationSystem和2抗体购自Sigma公司,兔抗phosphoSmad2抗体购自upstatebiotechnology公司,兔抗αSMA抗体购自Dako公司,兔抗Ecadherin抗体购自B＆D公司。AAVHelperFreeSystem（pAAVMCSvector、pAAVLacZvector、pAAVRCplasmid、pHelperplasmid）和XL10Gold感受态细菌,购自Stratagene公司。E.coliDH5α由本校分子遗传教研室馈赠。含全长Smad6/Flag和Smad7/Flag融合基因表达质粒,由

6、瑞典SerhiySouchelnytskyi博士惠赠。HEK293和HKC细胞购自美国ATCC。1.2方法1.2.1Smad6和Smad7AAV的产生及鉴定首先将Smad6/Flag和Smad7/Flag片段从质粒pcDNA3中用EcoRI/BamHI双酶切出,再克隆到pAAVMCSvector质粒的多克隆位点,正式命名为pAAVSmad6/Flag和pAAVSmad7/Flag质粒。按Stratagene公司AAVHelperFreeSystem转染试剂盒以磷酸钙沉淀的方法产生Smad6和Smad7AAV。以1mL病毒储存液感染HKC细胞48h后表达转移基因阳性细胞数（SABC组

7、化）来计算。1.2.2HKC细胞的培养及实验分组HKC细胞用含100mL/L的胎牛血清,100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640培养液传代培养,培养条件为37℃、50mL/LCO2。细胞随机分为正常对照、TGFβ1组、Smad7组、LacZ组、TGFβ1+Smad7或Smad6组、TGFβ1＋LacZ组。实验分三步骤进行,第一步观察10μg/LTGFβ1对HKC细胞磷酸化Smad2水平的影响,