杆状病毒介导的dnmtlsirna对人胰腺癌裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究

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1、江苏大学硕士学位论文杆状病毒介导的DNMTlsiRNA对人胰腺癌裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究姓名：欧亮申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：陈吉祥20120607江苏大学硕士学位论文摘要目的：观察介导RNA干扰(RNAi)DNA甲基转移酶I(DNMTl)基因表达的杆状病毒载体(Bac．si．DNMTl．D)作用人胰腺癌裸鼠移植瘤组织后胰腺癌细胞生长和凋亡的情况及对裸鼠的毒副作用；检测肿瘤细胞中DNMTl基因的表达和抑癌基因启动子区域甲基化的变化；初步探索运用杆状病毒介导的DNMTlsiRNA治疗胰腺癌的可行性及其分子机制。方法：1．建立人胰腺癌SW

2、l990细胞裸鼠移植瘤模型，选取24只，随机分为4组：生理盐水组、空载体组、低浓度病毒组及高浓度病毒组。隔天向瘤内注射重组病毒或生理盐水0．1ml，共8次，与此同时测量各组肿瘤体积变化。实验进行25天后处死裸鼠，采集移植瘤标本，并测量移植瘤重量及体积，绘制移植瘤生长曲线。2．裸鼠处死后收集裸鼠血清，检测血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肌酐(co及尿素氮(BUN)的含量。3．在无菌操作下采集裸鼠的心、肝、肾及移植瘤标本，使用HE染色法观察各组间标本的病理变化。4．脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测杆状病毒

3、载体作用后各组裸鼠移植瘤细胞凋亡情况。5．实时荧光定量聚合酶链反应(Real．timePCR)检测各组裸鼠移植瘤细胞中DNMTlmRNA的表达情况。6．免疫印迹法(Westernblot)检测各组裸鼠移植瘤细胞中DNMTl、B细胞淋巴瘤／白血病基因伴随蛋白X(Bax)和B细胞淋巴瘤／白血病基因．2(Bcl．2)的蛋白表达情况。7．甲基化特异性PCRT杆状病毒介导的DNMTlsiRNA对人胰腺癌裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究(MSP)方法检测各组裸鼠移植瘤细胞中IMR-b、p16、GST-p、hMLHl基因启动子区甲基化情况。8．逆转录PCR(RT-PC

4、R)检测各组裸鼠移植瘤细胞中RAR．bmRNA表达情况。结果：1．两病毒组肿瘤生长较对照组明显被抑制；瘤重：空载体组(1．00士0．29)g、生理盐水组(O．96土0．18)g、低浓度病毒组(O．54士0．35)g和高浓度病毒组(O．49士O．36)g。两病毒组肿瘤瘤重小于两对照组衅O．05)。2．各组荷瘤裸鼠的血清检测发现天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)的含量的差异均无统计学意义(尸>O．05)。3．光镜下确认所取组织为恶性肿瘤组织；镜下心、肝及肾组织结构正常，未见有炎症、变性、坏死、细胞凋亡及转移性

5、癌细胞等。4．空载体组、生理盐水组、低浓度病毒组和高浓度病毒组的凋亡指数分别为(16．4i8．5)％、(22．8+6．7)％、(49．3士4．6)％和(52．4士5．2)％，两病毒组的凋亡率明显高于空载体组和生理盐水组BO．01)，但两病毒组间无明显差异(尸>O．05)。5．实时荧光定量PCR示低浓度病毒组和高浓度病毒组肿瘤组织中DNMTlmRNA的表达量为(O．2210．07)和(O．09i0．os)，显著低于生理盐水组的(1．01士O．18)并H空载体组(O．96土0．35，P<0．01)。6．Westernblot结果示两病毒组肿瘤组织中DNM

6、Tl及Bcl．2蛋白表达低于两对照组，但Bax高于两对照组(P<0．05)。7．MSP结果显示DNMTlsiRNA杆状病毒干扰胰腺癌移植瘤后肿瘤细胞中RAR．b基因启动子区发生去甲基化改变。8．RT-PCR结果与MSP检测结果相对应，RNA干扰后肿瘤细胞内RAR．b基因重新表达。江苏大学硕士学位论文结论：1．杆状病毒介导的DNMTlsiRNA载体在体内可以有效抑制DNMTl基因的表达。2．杆状病毒介导的DNMTlsiRNA载体能促使胰腺癌细胞发生凋亡及生长抑制，其机制可能与肿瘤细胞中RAR．b基因启动子区发生去甲基化改变，基因重新表达有关。3．杆状病

7、毒介导的DNMTlsiRNA载体对裸鼠无毒性作用，提示其可以作为安全治疗胰腺癌的潜在途径。关键词：胰腺癌，DNA甲基转移酶1，RNA干扰，杆状病毒III江苏大学硕士学位论文ABSTRACTObjective：Toobservetheeffectsofcellgrowthandapoptosisbybaculovirus-mediatedRNAinterferenceofDNAmethyltransferasel(Bac-si-DNMT1一D)onthehumanpancreaticcancerxenograflinnudemice，detectthe

8、toxicityofthebaculovirusvectorinnudemice，andexaminethe