腺病毒介导存活素rna干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用

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1、腺病毒介导存活素RNA干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用作者：谢富华,王润秀,李莉萍，覃燕梅，梁念慈【摘要】目的：研究腺病毒介导的RNA干涉（RNAinterference,RNAi）沉默存活素（Survivin）表达后，对MCF7细胞裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑制作用.方法：构建携带survivinshRNA表达质粒的腺病毒Adsurvivin，并检测其滴度；建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型；将重组腺病毒悬液行瘤周和瘤体注射，观察肿瘤生长情况；剥离瘤体称重并计算药物的抑瘤率；免疫组织化学检测Survivin蛋白表达情况.结果：成功建立人乳腺癌肿瘤模型，移植瘤成功率为90%（1

2、8/20）；给药后实验组移植瘤的生长速度慢于对照组；病理学检查为浸润性导管癌；剥离肿瘤组织称重发现实验组抑瘤率为28.89%（P<0.05）；免疫组化发现实验组Survivin蛋白表达区的吸光度值为（15.63±1.54），明显低于阴性对照组（30.45±6.72）和空白对照组（30.25±6.58），差异均有统计学意义（P<0.05）.结论：以腺病毒为载体，以survivin基因为靶点RNAi介导的基因治疗方法有望成为乳腺癌一种新的治疗策略.【关键词】RNA干扰;存活素（survivin）;重组腺病毒；裸鼠；基因治疗0引言存活素（Survivin）作为一种

3、凋亡抑制蛋白，通过多条细胞信号传导通路抑制细胞凋亡，除了1等通路可能参与乳腺癌Survivin蛋白的调控外［1-2］，尚有许多细胞因子如VEGF，p27，Stat5等也与Survivin蛋白相关［3-5］.目前，应用RNA干扰技术、核酶技术、反义核苷酸技术等进行的靶向survivin基因治疗研究，大多为体外实验，而在体内对肿瘤的生长抑制作用的研究还少见报道.本研究在建立乳腺癌动物模型的基础上，以Survivin蛋白为靶点，通过RNAi技术和重组腺病毒技术，对乳腺癌的基因治疗进行体内研究，以期通过观察肿瘤生长抑制情况，探索肿瘤基因治疗的新途径，为实现抗乳腺癌生长与转移提

4、供理论依据.1材料和方法1.1材料Blal/bnu/nu雌性裸小鼠20只，4～6bion公司）；小剂量腺病毒纯化试剂盒（广州展晨生物技术有限公司）；免疫组织化学检测试剂盒，SurvivinmAb（北京中杉金桥生物技术有限公司）.1.2方法1.2.1重组腺病毒的构建与纯化将前期实验中构建的survivinshRNA表达质粒和阴性对照质粒，按pSilenceradeno1.0CMV试剂盒与腺病毒纯化试剂盒说明书构建并纯化重组腺病毒,分别命名为Adsurvivin和Adcontrol.1.2.2重组腺病毒滴度测定采用图1给药后各组肿瘤生长曲线2.3移植瘤组织病理学观察

5、移植瘤呈椭圆形或分叶状生长（图2），质地硬，切面灰白.光镜下可见移植瘤细胞形状不规则，大小不均一，核大浓染，核异形性明显，有病理性核分裂像，核浆比例明显增大.各组裸鼠的肝、肺脏组织未见损伤和瘤细胞转移（图3）.2.4siRNA药物的抑瘤作用接种后35d处死裸鼠，剥离瘤体称重发现：Adsurvivin组瘤体质量为（0.32±0.04）g，低于PBS组（0.45±0.06）g和Adcontrol组（0.41±0.06）g，其差异具有统计学意义（P<0.05），表明Adsurvivin组肿瘤细胞增殖受到抑制，抑制率为28.89%；而Adcontrol组和PBS组

6、间的差异无统计学意义（P>0.05）.2.5移植瘤组织Survivin蛋白表达免疫组化结果显示（图4），Survivin抗原表达于移植瘤细胞质内，阳性细胞呈棕黄色或棕褐色.Motic医学图像分析各组棕黄色或棕褐色区域的累积吸光度值，Adsurvivin组为（15.63±1.54），低于PBS组（30.45±6.72）和Adcontrol组（30.24±6.58），其差异具有统计学意义（P<0.05）.表明Adsurvivin组肿瘤细胞中Survivin蛋白表达受到抑制；而Adcontrol组和PBS组间的差异无统计学意义（P>0.05）.3讨论

7、Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，能抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用.以survivin基因为靶点的RNAi研究最早报道于2003年，Carvalho等［12］用siRNA转染HeLa细胞，60h后采用MC7721细胞，发现转染细胞中几乎没有survivin基因的表达，转染细胞自发的凋亡增加，G2/M期细胞比例减少，细胞增殖减慢.如今针对survivin基因的RNAi研究进展迅速，体外实验显示了良好的效果，但体内研究的报道尚不多见.