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时间:2018-11-24
《腺病毒介导存活素rna干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、腺病毒介导存活素RNA干涉对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用作者:谢富华,王润秀,李莉萍,覃燕梅,梁念慈【摘要】目的:研究腺病毒介导的RNA干涉(RNAinterference,RNAi)沉默存活素(Survivin)表达后,对MCF7细胞裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑制作用.方法:构建携带survivinshRNA表达质粒的腺病毒Adsurvivin,并检测其滴度;建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型;将重组腺病毒悬液行瘤周和瘤体注射,观察肿瘤生长情况;剥离瘤体称重并计算药物的抑瘤率;免疫组织化学检测Survivin蛋白表达情况.结果:成功建立人乳腺癌肿瘤模型,移植瘤成功率为90%(1
2、8/20);给药后实验组移植瘤的生长速度慢于对照组;病理学检查为浸润性导管癌;剥离肿瘤组织称重发现实验组抑瘤率为28.89%(P<0.05);免疫组化发现实验组Survivin蛋白表达区的吸光度值为(15.63±1.54),明显低于阴性对照组(30.45±6.72)和空白对照组(30.25±6.58),差异均有统计学意义(P<0.05).结论:以腺病毒为载体,以survivin基因为靶点RNAi介导的基因治疗方法有望成为乳腺癌一种新的治疗策略.【关键词】RNA干扰;存活素(survivin);重组腺病毒;裸鼠;基因治疗0引言存活素(Survivin)作为一种
3、凋亡抑制蛋白,通过多条细胞信号传导通路抑制细胞凋亡,除了1等通路可能参与乳腺癌Survivin蛋白的调控外[1-2],尚有许多细胞因子如VEGF,p27,Stat5等也与Survivin蛋白相关[3-5].目前,应用RNA干扰技术、核酶技术、反义核苷酸技术等进行的靶向survivin基因治疗研究,大多为体外实验,而在体内对肿瘤的生长抑制作用的研究还少见报道.本研究在建立乳腺癌动物模型的基础上,以Survivin蛋白为靶点,通过RNAi技术和重组腺病毒技术,对乳腺癌的基因治疗进行体内研究,以期通过观察肿瘤生长抑制情况,探索肿瘤基因治疗的新途径,为实现抗乳腺癌生长与转移提
4、供理论依据.1材料和方法1.1材料Blal/bnu/nu雌性裸小鼠20只,4~6bion公司);小剂量腺病毒纯化试剂盒(广州展晨生物技术有限公司);免疫组织化学检测试剂盒,SurvivinmAb(北京中杉金桥生物技术有限公司).1.2方法1.2.1重组腺病毒的构建与纯化将前期实验中构建的survivinshRNA表达质粒和阴性对照质粒,按pSilenceradeno1.0CMV试剂盒与腺病毒纯化试剂盒说明书构建并纯化重组腺病毒,分别命名为Adsurvivin和Adcontrol.1.2.2重组腺病毒滴度测定采用图1给药后各组肿瘤生长曲线2.3移植瘤组织病理学观察
5、移植瘤呈椭圆形或分叶状生长(图2),质地硬,切面灰白.光镜下可见移植瘤细胞形状不规则,大小不均一,核大浓染,核异形性明显,有病理性核分裂像,核浆比例明显增大.各组裸鼠的肝、肺脏组织未见损伤和瘤细胞转移(图3).2.4siRNA药物的抑瘤作用接种后35d处死裸鼠,剥离瘤体称重发现:Adsurvivin组瘤体质量为(0.32±0.04)g,低于PBS组(0.45±0.06)g和Adcontrol组(0.41±0.06)g,其差异具有统计学意义(P<0.05),表明Adsurvivin组肿瘤细胞增殖受到抑制,抑制率为28.89%;而Adcontrol组和PBS组
6、间的差异无统计学意义(P>0.05).2.5移植瘤组织Survivin蛋白表达免疫组化结果显示(图4),Survivin抗原表达于移植瘤细胞质内,阳性细胞呈棕黄色或棕褐色.Motic医学图像分析各组棕黄色或棕褐色区域的累积吸光度值,Adsurvivin组为(15.63±1.54),低于PBS组(30.45±6.72)和Adcontrol组(30.24±6.58),其差异具有统计学意义(P<0.05).表明Adsurvivin组肿瘤细胞中Survivin蛋白表达受到抑制;而Adcontrol组和PBS组间的差异无统计学意义(P>0.05).3讨论
7、Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员,具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子,能抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用.以survivin基因为靶点的RNAi研究最早报道于2003年,Carvalho等[12]用siRNA转染HeLa细胞,60h后采用MC7721细胞,发现转染细胞中几乎没有survivin基因的表达,转染细胞自发的凋亡增加,G2/M期细胞比例减少,细胞增殖减慢.如今针对survivin基因的RNAi研究进展迅速,体外实验显示了良好的效果,但体内研究的报道尚不多见.
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