自体肿瘤特异性ctls对裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑瘤作用

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1、自体肿瘤特异性CTLs对裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑瘤作用：杨超,单保恩刘运江,王士杰【摘要】目的:研究乳腺癌患者腋下淋巴结细胞诱导产生的肿瘤特异性CTLs在裸鼠体内对患者自身乳腺癌生长的抑制作用。方法:在裸鼠胸垫处种植人乳腺癌组织,建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型。以细胞因子联合诱导乳腺癌患者腋窝淋巴结单个核细胞成为DC和肿瘤特异性CTL（sCTL）、非特异性CTL（nCTL）和异体CTL（vCTL）;将不同CTLs注射到荷瘤裸鼠的肿瘤周围,观察其对肿瘤生长的抑制作用。结果:人乳腺癌移植瘤在裸鼠体内的成活率为100％。组织病理学证实移植瘤为乳腺浸润性导管癌。

2、与对照组相比,荷瘤裸鼠移植瘤的体积在sCTL、nCTL和vCTL治疗组均明显减小(P<0.05),sCTL对自体移植瘤的生长抑制作用最强［平均瘤体积(82.70±2.09)mm3］,抑瘤率50.5％,明显高于nCTL组［(96.15±5.35)mm3,26.9％］和vCTL组［(96.93±4.51)mm3,25.7％］,(P＜0.01);不同CTL治疗组瘤组织内可见大量淋巴细胞和树突状细胞(DC)浸润。结论:乳腺癌裸鼠移植瘤模型成功率高,病理学证实与人乳腺癌特征相符,且有DC和大量特异性CTL浸润。自体特异性CTL对裸鼠体内自体乳腺癌移植

3、瘤有较强的抑制作用。【关键词】乳腺癌;肿瘤引流区淋巴结细胞;裸鼠模型;免疫治疗乳腺癌是当今危害妇女健康的主要恶性肿瘤。虽经手术、化疗、放疗及内分泌治疗等综合治疗,但40%患者仍死于肿瘤复发和转移［1］。近年来,随着肿瘤免疫学的发展,以树突状细胞（dendriticcell,DC）为基础构建的乳腺癌疫苗成为当今研究的热点。本研究中我们以细胞因子联合诱导培养腋下淋巴结细胞为DC和肿瘤特异性CTL,观察其对裸鼠乳腺癌移植瘤生长的抑制和杀伤作用。1材料和方法1.1材料选取2005-11/2006-02在我科住院手术的乳腺癌患者10例,年龄41～67岁,中

4、位年龄52.9岁,均为女性,术前均未行放、化疗,术后病理为乳腺浸润性导管癌。手术时无菌摘取腋窝引流区肉眼判断无肿瘤转移的淋巴结2～3枚,选取其中2例患者的肿瘤组织切成约1.5cm3,用于建立裸鼠移植瘤模型。实验动物:SPF级BALB/c裸鼠（32只,3～4周龄,体质量13～15g,雌性）购于中国医学科学院动物中心。RMPI1640培养基购自Promega公司;胎牛血清购自杭州四季青生物试剂公司;rhGMCSF、rhIL2、rhIL4购自Cytolab公司;抗CD1a、CD83、CD86单克隆抗体（mAb）购自Biolegend公司;抗CD3

5、mAb、抗CD4、CD8mAb购自Coulter公司。1.2方法1.2.1DC的诱导培养、自体肿瘤特异性CTL、nCTL和vCTL的制备术中取其中1名乳腺癌患者（A）区域引流淋巴结制成单细胞悬液,分离贴壁细胞,用rhGMCSF和rhIL4诱导培养为DC,并与乳腺癌细胞冻融悬液共培养,使之负载肿瘤抗原;DC与悬浮淋巴细胞共培养为特异性CTL(specificCTL,sCTL);未负载肿瘤抗原的DC刺激淋巴细胞产生非特异性CTL（nonspecificCTL,nCTL),vCTL制备方法同异体CTL(varientCTL,sCTL),但是用其杀伤

6、另一名患者（B）肿瘤。详细方法参照文献［2］。1.2.2人乳腺癌裸鼠移植瘤模型的建立及处理将2名患者乳腺癌组织块种植于裸鼠胸垫皮下,2周后,移植瘤生长良好,将裸鼠随机分为4组,每组8只。（1）肿瘤特异性CTL治疗组:每只裸鼠每次于肿瘤局部注射自体肿瘤特异性CTLs（5×109/L）0.2mL;（2）非特异性CTL治疗组:每只裸鼠每次局部注射非特异性CTLs（5×109/L）0.2mL;（3）异体CTL治疗组:种植另一患者（B）乳腺癌组织,每只裸鼠每次于肿瘤局部注射患者（A）自体肿瘤特异性CTLs（5×109/L）0.2mL;(4)空白对照组:每只

7、裸鼠于肿瘤局部注射生理盐水0.2mL。以上各组每5d肿瘤周围注射1次,共3次。每5d用游标卡尺测量记录肿瘤长径（a）、短径（b）,按体积(V)=πab2/6计算肿瘤体积。30d脱颈处死裸鼠取出移植瘤标本。肿瘤生长抑制率＝｛［1－(实验组结束时瘤体积－实验组开始时瘤体积)］/(空白对照组结束时瘤体积－空白对照组开始时瘤体积｝×100％。1.2.3移植瘤的组织学观察将移植瘤取出后制成石蜡切片,常规HE染色,显微镜观察肿瘤细胞的形态学和凋亡情况;免疫组化SP法观察DCs（标志物为CD83）和特异性CTL（标志物为CD3、CD4、CD8）浸润情况。1.2

8、.4统计学分析应用SPSS11.5统计软件进行统计。各组移植瘤体积和抑瘤率用x±s表示;3种治疗方法是否有明显差异采用GeneralLi