人乳腺癌裸鼠移植瘤的体外抗生素诱导基因治疗

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1、人乳腺癌裸鼠移植瘤的体外抗生素诱导基因治疗作者：曾赵军，胡维新，李子博，罗赛群【摘要】目的探讨Tet调控下体外抗生素诱导基因治疗人乳腺癌裸鼠移植瘤的可行性。方法构建人乳腺癌BALB/C裸鼠移植瘤模型,制备有感染活性的重组逆转录病毒RevTRE/HSVtk与RevTetOn。观察体外强力霉素（Dox）诱导,丙氧鸟苷（GCV）和逆转录病毒作用后移植瘤生长的变化及组织病理改变,分析其对乳腺癌裸鼠移植瘤的调控性治疗作用。结果乳腺癌裸鼠治疗后，肿瘤体积明显减小，生长受抑，生存周期延长,组间比较有显著性差异（P<

2、;0.05）。瘤体HE染色显示治疗组肿瘤局部有炎性细胞浸润和强嗜酸性细胞。RTPCR结果显示Dox诱导后瘤体组织HSVtk表达较明显。结论通过逆转录病毒介导Tet调控，可以在体外抗生素Dox诱导下对人乳腺癌裸鼠移植瘤模型进行基因治疗，杀伤肿瘤细胞。【关键词】乳腺癌；基因治疗；裸鼠；逆转录病毒；基因调控基金项目：美国中华医学会（CMB）基金资助项目（#99698）Keyice；Retrovirus；Antibiotic自杀基因治疗是近年来肿瘤治疗研究的热点之一。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)在体细胞内

3、能将无毒的药物前体GCV代谢为有毒物质，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而清除肿瘤［1］。本实验用含有调控因子TetOn和HSVtk基因的重组逆转录病毒与底物GCV处理后,在体外强力霉素作用下观察对人乳腺癌BALB/C裸鼠移植瘤模型肿瘤生长、瘤体大小以及肿瘤组织病理学等改变,分析肿瘤组织内HSVtk基因表达的变化。以探讨在体外抗生素诱导下,自杀基因对乳腺癌细胞株MCF7移植的乳腺癌裸鼠的体外调控性治疗作用。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞与动物人乳腺癌细胞株MCF7、PA317、NIH3T3来自中南

4、大学湘雅医学院细胞中心。年龄4周的雌性BALB/c裸鼠（nu/nu）购于中国医学科学院上海实验动物中心。1.1.2主要试剂和质粒质粒载体pRevTRE、pRevTetOn购自美国Clontech公司，质粒pGEM7Ztk由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所曹亚教授惠赠。pRevTRE/HSVtk由本中心构建［2］，含有四环素反应元件（TRE）和自杀基因HSVtk。限制性内切酶购自Roche公司和Promega公司。G418、潮霉素、DMEM、0.25%胰蛋白酶、RNATRIzol试剂盒均购自GibcoB

5、RL公司。GCV、Dox购自美国Sigma公司。其余试剂购自Sigma公司。1.2逆转录病毒的制备、纯化与滴度测定通过改进的“微乒乓感染法”将质粒逆转录病毒载体导入包装细胞PA317中，以潮霉素B或G418筛选克隆细胞，浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒［3］。得到病毒后纯化并测定其滴度。1.3BALB/c裸鼠移植瘤模型的建立、分组和干预方法模型的构建：取对数生长期的MCF7细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗2遍，离心1000r/min4min，无血清的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数使细胞密度达2

6、×106/ml，以0.2ml细胞悬液注射接种于BALB/c裸鼠左侧近前腋处皮下并作好标记。细胞接种后，观测裸鼠生长状况。动物分组和干预：待裸鼠皮下肿瘤长至0.7～0.8cm后，按随机数字表法将裸鼠随机分为4组，即培养基DMEM组、GCV+病毒组、GCV+Dox组、Dox+GCV+病毒治疗组，每组8只，苦味酸标记。GCV+病毒组、Dox+GCV+病毒治疗组荷瘤裸鼠皮下肿瘤内给予注射病毒悬液，病毒滴度为1×106CFU/ml，每周2次，连续2周。同时注射病毒悬液第2周开始GCV+Dox组、Dox+GCV+病毒治

7、疗组荷瘤裸鼠皮下肿瘤内给予注射Dox0.1ml（100mg/kg），连续7d。DMEM组给予腹腔注射DMEM培养基0.2ml，GCV+病毒组、GCV+Dox组、Dox+GCV+病毒治疗组均给予腹腔注射GCV（100mg/kg）各0.2ml，每天上下午各1次，连续14d。治疗前后每隔3d均用游标卡尺测量肿瘤瘤体长径b和短径a，监测荷瘤裸鼠体重及生长状况。肿瘤体积按V=π(a2×b)/2(mm3)公式计算。同时记录下荷瘤裸鼠的生存时间。1.4BALB/c裸鼠移植瘤组织病理形态学检测治疗结束后BALB/c裸鼠以2

8、%戊巴比妥钠（20mg/kg）腹腔内注射麻醉。解剖BALB/c裸鼠，观察肿瘤与周围组织粘连、浸润生长及淋巴转移情况。取出肿瘤组织，除去结缔组织，在无菌条件下称量每只BALB/c裸鼠新鲜肿瘤瘤体湿重并拍照。计算肿瘤生长抑制率：（1-不同处理组瘤重/对照组瘤重）×100%。然后肿瘤组织用无菌生理盐水快速冲洗2～3次，留取部分肿瘤迅速投入液氮中保存作RTPCR分析HSVtk基因表达用；余下部分肿瘤从最大面切开肿瘤，肉