蟾毒灵对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用 及对bcl

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1、蟾毒灵对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用及对Bcl作者：顾伟，韩克起，苏永华，黄雪强，凌昌全【摘要】探讨蟾毒灵对裸鼠人肝癌原位移植模型的抗肿瘤作用及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法:建立裸鼠人肝癌原位移植模型，随机分为蟾毒灵高（1.5mg/kg）、中（1mg/kg）、低（0.5mg/kg）剂量治疗组，阿霉素8mg/kg治疗组和模型组。裸鼠人肝癌原位移植模型第25天测量肿瘤体积，取瘤组织做HE染色观察肿瘤坏死程度并行电镜观察，DNA原位末端标记法检测凋亡标记指数，免疫组化法检测肝癌组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:蟾毒灵各剂量组肿瘤体积均较模型组明显缩小（

2、P<0.01），生存期较阿霉素治疗组及模型组延长（P<0.05）。电镜观察到蟾毒灵各组肿瘤出现明显的细胞凋亡征象，低、中、高剂量治疗组的凋亡指数分别为5.87±2.13、8.86±2.96和10.60±3.42，明显高于阿霉素治疗组的3.28±0.98（P<0.05或P<0.01）;蟾毒灵各组瘤组织的Bax表达明显增强，而Bcl-2表达无明显改变。结论:蟾毒灵对裸鼠人肝癌原位移植模型有明显的抗肿瘤作用，其作用机制可能与上调Bax表达、诱导细胞凋亡有关。【关键词】蟾毒灵;肝癌;细胞凋亡;Bcl-2;Bax;裸小鼠　蟾毒灵（bufalin）是从

3、中药蟾酥中提取的一种毒性配基之一，分子式为C24H32O4，相对分子质量为386.5。研究表明，蟾毒灵具有诱导肿瘤细胞分化和凋亡的作用，主要涉及到白血病、前列腺癌、胃癌、肝癌等人类肿瘤，且仅限于体外研究［1～4］。本文旨在探讨蟾毒灵对人肝癌裸鼠原位移植模型的体内抗肿瘤效应及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。　　1材料和方法　　1.1实验材料　　1.1.1实验动物和瘤株BALB/C-nu/nu裸鼠，由复旦大学实验动物中心提供，SCKK（沪）2003-0003，4～5周龄，体质量18～20g，雄性，在无特殊病原菌条件下分笼饲养。人肝癌细胞株BEL-7402，由中国科

4、学院上海细胞生物学研究所提供，由第二军医大学长海医院中医科实验室传代冻存。　　1.1.2药物和试剂蟾毒灵，美国Sigma公司产品;阿霉素（adriamycin，ADM），深圳万乐药业有限公司产品;DNA原位末端标记试剂盒，BoehringerMannhEin公司产品;鼠抗人Bcl-2和Bax蛋白单克隆抗体，SantaCruz公司产品。　　1.2实验方法　　1.2.1模型分组及处理参照　　Table2LabelindexoftumorcellapoptosisandexpressionsofBcl-2andBaxintumortissues　　*P<0.05，

5、**P<0.01，vsNS-treatedgroup.　　图3裸鼠原位肝内移植瘤Bax蛋白的表达（SP法，×200）（略）　　Figure3ExpressionofBaxinorthotopicallytransplantedtumorofhumanhepatocellularcarcinomainnudemice（SPmethod，×200）　　A:Baxexpressedg/kg［12］，本实验预实验也发现2mg/kg的一次性给药剂量就可使小鼠发生一过性的痉挛性抽搐，但未引起小鼠中毒性死亡。鉴于此，本实验主要研究给予1.5mg/kg及以下剂量蟾毒灵时动物

6、体内的抗肿瘤作用。人类肿瘤裸鼠原位移植瘤模型是抗癌药物筛选和机制研究较为理想的动物模型，我们成功建立了裸鼠人肝癌原位移植模型，在此基础上观察蟾毒灵对裸鼠原位人肝癌移植模型的抗肿瘤效果，结果表明蟾毒灵按总量15、10和5mg/kg分10d连续给药治疗裸鼠原位人肝癌移植性模型在瘤体缩小方面具有与阿霉素8mg/kg相同的疗效，且在带瘤生存期的延长及模型生活质量（体质量的增减）的改善方面，蟾毒灵各治疗组明显优越于阿霉素治疗组。提示蟾毒灵在体内具有良好的抗肝癌作用。病理学及TUNEL检测结果发现，高、中剂量蟾毒灵不仅能导致肝癌组织中、重度坏死及大量纤维结缔组织增生，而且能原

7、位诱导肝癌细胞凋亡，凋亡标记指数与蟾毒灵给药呈剂量依赖性。细胞凋亡是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起的细胞主动死亡的过程。Bcl-2基因家族是细胞凋亡研究中最受重视的基因，目前已发现几个与Bcl-2同源的基因，包括Bcl-xL、Bcl-xs、Bax、Bak、mcl-1、A1、Bag-1、Bfl-1、ced9、BHRF-1等，构成了Bcl-2家族。其中Bax基因是Bcl-2家族中的一员，其生物学作用是拮抗Bcl-2，与Bcl-2形成二聚体，抑制或促进细胞凋亡。Bcl-2和Bax的比例决定细胞的凋亡状态:Bcl-2表达水平高于Bax时，Bcl-

8、2和Bcl